הדמיה ג elegans עוברים באמצעות מיקרוסקופ Epifluorescent ותוכנות קוד פתוח
Summary
<em> ג elegans</emהעובר> היא מערכת רבת עוצמה ללימוד ביולוגיה של התא ופיתוח. אנו מציגים פרוטוקול הדמיה חיה של<em> ג elegans</em> עוברים ניצול אופטיקה DIC או באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי epifluorescent זמינים מקור פתוח תוכנה.
Abstract
תהליכים תאיים, כגון הפרדה הרכבה, כרומוזום ו cytokinesis, הם דינמיים מטבעם. זמן לשגות הדמיה של תאים חיים, באמצעות ניאון שכותרתו חלבונים הכתב או הפרעה ההפרש לעומת זאת (DIC) מיקרוסקופיה, מאפשר בחינה של התקדמות הזמני של האירועים הללו דינמי אשר להסיק אחרת מניתוח של 1,2 דגימות קבוע. יתרה מכך, המחקר של תקנות התפתחותיים של תהליכים תאיים מחייבת ניהול זמן לשגות ניסויים על אורגניזם שלם במהלך הפיתוח. העובר elegans Caenorhabiditis אור שקוף יש תוכנית מהירה, התפתחותי משתנה עם תא ידוע שושלת 3, ובכך לספק מודל ניסוי אידיאלי לבחינת שאלות בביולוגיה של התא 4,5 ופיתוח 6-9. ג elegans היא amendable כדי מניפולציה גנטית על ידי קדימה גנטיקה (מבוסס על mutagenesis אקראי 10,11) גנטיקה הפוכה למקד גנים ספציפיים (מבוסס על הפרעה RNAi בתיווך ממוקד mutagenesis 12-15). בנוסף, חיות טרנסגניות ניתן ליצור בקלות להביע את החלבונים המתויגים fluorescently או כתבים 16,17. תכונות אלה משלבים כדי שיהיה קל לזהות את המסלולים הגנטיים בוויסות תהליכים תאיים והתפתחותית היסוד in vivo 18-21. בפרוטוקול זה אנו מציגים שיטות הדמיה חיה של C. עוברים elegans באמצעות אופטיקה DIC או פלואורסצנטי GFP על מיקרוסקופ epifluorescent המתחם. אנו מדגימים את הקלות שבה מיקרוסקופים זמינים, משמש בדרך כלל הדמיה מדגם קבוע, יכול להיות מיושם גם לניתוח זמן לשגות באמצעות תוכנות קוד פתוח כדי למכן את תהליך ההדמיה.
Protocol
Discussion
שיקול מרכזי עבור דימות זמן לשגות לחיות היא לשמר את היושרה ואת הכדאיות של התא ושל האורגניזם. מיקרוסקופיה DIC מספק את היתרון כי המדגם אינו נחשף לאור אולטרה סגול וחימום יתר ממקור תאורה. מיקרוסקופיה DIC הוא גם מתאים כדי לזהות נדידת תאים וצורתם תא שינויים כגון cytokinesis כדי לזהות כמה מבנים subcellular, כגון ציר mitotic ואת קרום הגרעין. דימות פלואורסצנטי של חלבונים כתב משלים מיקרוסקופיה DIC ידי זיהוי תאים subcellular נוסף המאפשר הדמיה של חלבונים מסוימים. כדי להקטין את הסכנות של phototoxicity ופגיעה בעובר במהלך דימות פלואורסצנטי, אנחנו בדרך כלל להגדיל את הרווח דיגיטלי של המצלמה כדי לקזז את UV מופחת אור בעוצמה ומשך התאורה. עבור קלוש כתבים מהונדס פלורסנט, אלגוריתמים deconvolution כדי להקצות מחדש מחוץ להתמקד אלגוריתמים אור או deblurring להפחית רקע יכול לשפר את האיכות של התמונות שנתפסו. בעוד מיקרוסקופים מתקדמים, כגון מערכות confocal או multiphoton הם לפעמים יש צורך, מצאנו כי הכתבים ניאון רבים ניתן הדמיה באמצעות התקנה זו מיקרוסקופ epifluorescent, מניב תמונות באיכות גבוהה.
Micro-Manager (http://www.micro-manager.org), בנוסף להיותו חינם, שומר קבצים ישירות בפורמט TIFF במקום פורמטים של קבצים קניינית של הרבה חבילות תוכנה מסחריות. זו משמעותית מפשט את ניתוח הנתונים שלנו על ידי ביטול המרת קובץ הצעד הדרוש כדי לקרוא את קבצי התמונה ImageJ, Photoshop ו תוכנה אחרת לעריכת תמונות.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
כספים מוסדיים פנימיים למדעי חוקרים ביולוגיים תוכנית באוניברסיטת מישיגן נתמך העבודה הזאת.
Materials
Olympus BX61 microscope with Hamamatsu Orca-ER camera. 10x Plan Fluorite (NA 0.3) and 60x PlanAchromat (NA 1.35) objective lenses
Micro-Manager 1.3.46(http://www.micro-manager.org)
Image J 1.43 (http://rsbweb.nih.gov/ij)
loci_tools.jar (http://www.loci.wisc.edu)
Agarose – molecular biology/gel electrophoresis grade
Fisher Superfrost/Plus Microscope Slides (Catalog # 12-550-15)
Laboratory tape (Fisher Catalog # 15-901 Series)
18 mm x 18 mm #1.5 Coverslips
M9 (242 mM KH2PO4, 40 mM Na2HPO4, 9 mM g NaCl, 19 mM NH4Cl MgSO4)
(http://130.15.90.245/wormlab_recipe_book.htm).
Egg Buffer (118 mM NaCl, 48 mM KCl, 2 mM CaCl2, 2 mM MgCl2, 25 mM HEPES, pH 7.3)25.
Vaseline
Brush/Stick
Razor blades
Heat block
Dissecting microscope
Worms22
Platinum wire pick22
27G1/2 Precision Glide Needle (Beckton Dickinson) or a scalpel with a small blade
References
- Gerlich, D., Koch, B., Dupeux, F., Peters, J. M., Ellenberg, J. Live-cell imaging reveals a stable cohesin-chromatin interaction after but not before DNA replication. Curr Biol. 16, 1571-1578 (2006).
- Nabeshima, K. Dynamics of centromeres during metaphase-anaphase transition in fission yeast: Dis1 is implicated in force balance in metaphase bipolar spindle. Mol Biol Cell. 9, 3211-3225 (1998).
- Sulston, J. E., Schierenberg, E., White, J. G., Thomson, J. N. The embryonic cell lineage of the nematode Caenorhabditis elegans. Dev Biol. 100, 64-119 (1983).
- Oegema, K., Hyman, A. A. Cell division. WormBook. , 1-40 (2006).
- Heuvel, S. v. a. n. d. e. n. Cell-cycle regulation. WormBook. , 1-16 (2005).
- Chisholm, A. D., Hardin, J. Epidermal morphogenesis. WormBook. , 1-22 (2005).
- Gonczy, P., Rose, L. S. Asymmetric cell division and axis formation in the embryo. WormBook. , 1-20 (2005).
- Nance, J., Lee, J. Y., Goldstein, B. Gastrulation in C. elegans. WormBook. , 1-13 (2005).
- Priess, J. R. Notch signaling in the C. elegans embryo. WormBook. , 1-16 (2005).
- Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77, 71-94 (1974).
- O’Connell, K. F., Leys, C. M., White, J. G. A genetic screen for temperature-sensitive cell-division mutants of Caenorhabditis elegans. Genetics. 149, 1303-1321 (1998).
- Fire, A. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans [see comments]. Nature. 391, 806-811 (1998).
- Jansen, G., Hazendonk, E., Thijssen, K. L., Plasterk, R. H. Reverse genetics by chemical mutagenesis in Caenorhabditis elegans. Nat Genet. 17, 119-121 (1997).
- Liu, L. X. High-throughput isolation of Caenorhabditis elegans deletion mutants. Genome Res. 9, 859-867 (1999).
- Bazopoulou, D., Tavernarakis, N. The NemaGENETAG initiative: large scale transposon insertion gene-tagging in Caenorhabditis elegans. Genetica. 137, 39-46 (2009).
- Praitis, V., Casey, E., Collar, D., Austin, J. Creation of low-copy integrated transgenic lines in Caenorhabditis elegans. Genetics. 157, 1217-1226 (2001).
- Stinchcomb, D. T., Shaw, J. E., Carr, S. H., Hirsh, D. Extrachromosomal DNA transformation of Caenorhabditis elegans. Mol Cell Biol. 5, 3484-3496 (1985).
- Piano, F., Schetter, A. J., Mangone, M., Stein, L., Kemphues, K. J. RNAi analysis of genes expressed in the ovary of Caenorhabditis elegans. Curr Biol. 10, 1619-1622 (2000).
- Gonczy, P. Functional genomic analysis of cell division in C. elegans using RNAi of genes on chromosome III. Nature. 408, 331-336 (2000).
- Sonnichsen, B. Full-genome RNAi profiling of early embryogenesis in Caenorhabditis elegans. Nature. 434, 462-469 (2005).
- Mohler, W. A., Isaacson, A. B. Imaging embryonic development in Caenorhabditis elegans. Cold Spring Harb Protoc. , (2010).
- Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , 1-11 (2006).
- Bembenek, J. N. Cortical granule exocytosis in C. elegans is regulated by cell cycle components including separase. Development. 134, 3837-3848 (2007).
- Poteryaev, D., Squirrell, J. M., Campbell, J. M., White, J. G., Spang, A. Involvement of the actin cytoskeleton and homotypic membrane fusion in ER dynamics in Caenorhabditis elegans. Mol Biol Cell. 16, 2139-2153 (2005).
- Bianchi, L., Driscoll, M. Culture of embryonic C. elegans cells for electrophysiological and pharmacological analyses. WormBook. , 1-15 (2006).
