Nöron Soma ve Aksonlar compartmentalization mikroakışkan Aygıt Fabrikasyon

Bölüm 1: mikroakışkan nöron cihaz hazırlanması 3 "SU-8 fotolitografi tarafından yapılmış bir model silikon gofret polidimetilsiloksan (PDMS) mikroakışkan kalıp döküm için kullanılır. Master kalıpları, ya da gibi SU-8 desenli silikon gofret bakın" efendileri ". PDMS 10:1 w / w oranında sertleştirici ile karıştırılır, PDMS 10 gram, 1 gram sertleştirici eklenir. PDMS sonra iyice karıştırılır ve silikon yonga üzerine dökülür. Silikon gofret 10 cm polistren Petri kabı içinde yer alıyor. Yaklaşık 4 mm kalınlığı ile ana kapsayacak şekilde PDMS, yaklaşık 12 g 15 g alır. PDMS ile ana ardından Petri kabı kapağı kapalı bir vakum desikatöre yerleştirilir ve vakum uygulanır. Bu sertleştirici karıştırma sırasında tanıtıldı PDMS hava kabarcıkları yardımcı olmak için yapılır. Bu hava kabarcıkları için yaklaşık 15 dakika sürer. PDMS ile ana desikatöre kaldırılır. 0.45 um filtresi ile bir hava tabancası kalan tüm kabarcıklarını çıkarmak için kullanılır. Usta daha sonra tedavisi için 1 saat için 80 ° C sıcak plaka üzerine yerleştirilir. Not: bir vakum desikatöre mevcut değilse, ana birkaç saat oda sıcaklığında bırakılmalıdır. Bu hava kabarcıkları sonunda kendi kaybolacaktır. Sıcak bir levha mevcut değilse, PDMS oda sıcaklığında 24 saat sonra tedavi olacak. Not: ana kür işlemi sırasında düzey olduğundan emin olmak da önemlidir. Bölüm 2: Nöron mikroakışkan cihaz Kesme PDMS ana tedavi edildikten sonra, temiz bir kaput alınır. Cerrahi bıçak kullanarak, bir daire çevresinde cihazların kesilir. Bir PDMS içine bıçak ekler, silikon yonga ile temas kurmaya ama gofret çok fazla baskı önemlidir, başka ana çatlar. Cihazlar (her 3 "Silikon Yüksek Lisans başına 4 cihazları vardır) etrafında bir daire şekilde kesilmiş, PDMS ana dikkatlice kaldırdı. Önceden kesilmiş eklenir Bu cerrahi bıçak hafifçe bükerek başlamış olabilir . Sonra, rezervuarlar 8 mm doku biyopsisi yumruk kullanarak cihazın içine yumrukladı. Cihazlar, sonra dörde ve aşırı PDMS cihaz Corning Kapak Cam (No: 1) 24 mm x 40 mm uyacak böylece uzakta kesilmiş. Azot havanın herhangi bir aşırı enkaz darbe için kullanılır. İnatçı enkaz 3M Scotch Marka 471 vinil bant kullanarak silinebilir. Bölüm 3: Plazma cam kapak fişleri cihazlar yapıştırma. Plazma Cleaner kapak fişleri harrick nöron cihazlar bağ kullanılır. Kısacası, plazma temizleyici cihazlar yerleştirilir ve bir vakum pompası odasından havayı tahliye etmek için kullanılır. Vakum basıncı 300 milliTorr ulaşıldıktan sonra, güç elektrik bobini açık ve yüksek ayarlanır. – Elektrik bobini "elektronlar, iyonlar ve nötr atomlar veya moleküller oluşan kısmen iyonize gaz, plazma oluşturur http://www.harrickplasma.com/plasma_physics.php odasında kalan hava moleküllerini sol. Plazma reaktif türler, cam ve kalıcı bir bağ oluşturur birlikte yerleştirildiği zaman, cihaz, yüzeyleri oluşturur. Plazma da, sıvıların yanı sıra kolaylaştırmak yardımcı hidrofilik yüzeyleri, döner. Ayrıca, plazma temizleyici cihazlar sterilize eder. Mikroakışkan aygıtı içeren PDMS cihazın yüzey plazma temizleyici, cam slaytlar ile birlikte ön yüzü yukarıya yerleştirilir. Cam ve mikroakışkan cihaz plazma tedavi yüzeyler daha sonra steril 60 mm yemekler yerleştirilir, temiz bir tezgah birbirleri ile temas halinde monte edilir. Tedavi yüzeyleri sıkı bir geri dönüşü olmayan bir bağ oluşturur. 10 dakika içinde plazma cihazları cam yapıştırma, Poli-L-Lizin (PLL) cihaza eklenir. 10 dakika sonra, cihazın hydrophilicity PLL cihaz girmek için zor hale düşecektir. Not: PLL eklenmesinden sonra cihaz hava kabarcıkları kontrol etmek için önemlidir. Hücreler okside olduğu gibi ana kanal içinde hava kabarcıkları, istenmeyen. Varolan herhangi bir hava kabarcıklarını çıkarmak için kolay bir yöntem, 150 ul (bu durumda PLL) sıvı ile dolu bir P200 pipetlemeyin kullanmak için, ana kanal açılışında ucu doğrudan yerleştirin ve zorla P200 bastırın. Bu birkaç kez tekrar edilmesi gerekebilir ama sonunda kuvvet pipetlemeyin kabarcıkları sürücü olacaktır. PLL içeren cihazlar, 37 standart doku kültürü inkübatör geceleme inkübe izin ° C ile% 5 CO 2 . Ertesi gün de,kötü alışkanlıklardan otoklavlanmış dH2O iki kez hızlı bir şekilde durulanır. Bu işlem sırasında, sıvı tamamen sadece rezervuarları ana kanallar kaldırıldı asla. Ana kanal sıvı kaldırma kabarcıkları tanıtacak. 2 hızlı durular sonra, cihazlar otoklavlanmış dH2O ile doldurulur ve en az 3 saat bir inkübatör içine geri yerleştirilir ya da gecede vardır. Ertesi gün, cihazlar yine otoklavlanmış dH2O ile 2 kat hızlı durulanır. Ardından, gerekli takviyeleri B27 ve glutamax kültür birincil sıçan nöron içeren sinir bazal medya, cihazlar eklenir. Cihazlar, ileride kullanmak üzere inkübatör geri yerleştirilir. Şimdi, cihazlar nöronların tohumlama için hazırız.