التصوير الضوئي للخلايا العصبية في العقدة كراب فموي معدي مع الجهد حساسة للملونات
Summary
هنا نقدم منهجية سريع وارتفاع القرار التصوير الجهد الحساسة صبغة الفلورسنت لنشاط الخلايا العصبية في مفصل السلطعون عقدة فموي معدي.
Abstract
الجهد حساسة للصباغة التصوير من الخلايا العصبية هي منهجية أساسية لفهم كيفية تنظيم شبكات الخلايا العصبية وكيف يمكن للنشاط الخلايا العصبية في وقت واحد من المشاركة يؤدي إلى ظهور وظائف لا يتجزأ من الشبكة. هنا نقدم منهجية تطبيق هذه التقنية لتوليد الخلايا العصبية التي تم تحديدها في نمط العقدة السلطعون فموي معدي. علينا أن نظهر للتحميل من هذه الخلايا العصبية مع الفلورسنت الجهد صبغة حساسة للثنائي ANEPPQ – 8 و نظهر كيفية صورة نشاط الخلايا العصبية تحميل صبغ به من سرعة عالية وعالية MiCAM02 القرار CCD نظام التصوير بالكاميرا. نحن لشرح تحليل البيانات المسجلة التصوير باستخدام برنامج التصوير BVAna المرتبطة بنظام التصوير MiCAM02. تطبيق المتزامن الجهد التصوير صبغة حساسة للنشاط الخلايا العصبية تفصيلية متعددة في العقدة السلطعون فموي معدي جنبا إلى جنب مع التقنيات التقليدية الكهربية (داخل وخارج الخلية التسجيلات) يفتح بشكل جذري فرصا جديدة لفهم كيفية عمل مولد نمط الشبكات العصبية المركزية.
Protocol
1. إعداد النظام العصبي كراب فموي معدي تم الحصول على البالغين سرطان pagurus L. من مصادر محلية (جامعة نيوكاسل ، حمامة مختبرات البحرية) ويحتفظ بها في مياه البحر وتصفيتها الهوائية (10 — 12 درجة مئوية). وكانت الحيوانات التي تخدير تعبئتها في الثلج لمدة 20 — 40 دقيقة قبل تشريح. كنا معزولين الجهاز العصبي فموي معدي (STNS) 1. وكان يعلق على STNS أسفل في سيليكون الاستومر مبطنة طبق بيتري (ELASTOSIL RT – 601 ، فاكر ، ميونيخ ، ألمانيا) وsuperfused باستمرار (7 — 12 مل / دقيقة) مع مبرد المياه المالحة (10-13 درجة مئوية). وتألفت المالحة الفسيولوجية (ملمول * L – 1) : كلوريد الصوديوم ، 440 ؛ MgCl 2 ، 26 ؛ CaCl 2 ، 13 ؛ بوكل ، 11 ؛ trisma قاعدة ، 10 ؛ حمض المالئيك ، 5. وظل المالحة في درجة حرارة ثابتة من 11 — 13 درجة مئوية ودرجة الحموضة في 7،4-7،6. تعرض الخطوات التفصيلية للتشريح STNS والإعداد ، بما في ذلك desheathing من العقدة stomatoastric (STG) ، في مقالة كتبها Guttierez إن الرب وGrashow 1. وأجريت التجارب في جميع وفقا لتوجيهات المجلس الأوروبي المجتمعات ال 24 من نوفمبر 1986 (86/609/EEC). 1A الرقم يظهر الرسم التخطيطي للSTNS ويظهر الشكل 1B STG نموذجية desheathed جود الخلايا العصبية في شكل نصف دائرة ورتبت شقة في الجزء الخلفي من العقدة. تم إصلاح طبق بيتري مع STNS إلى منصة تشغيل المجهر التصوير (BW51 WI ، أوليمبوس ، طوكيو ، اليابان) مع الطين النمذجة. على حد سواء ، هي التي شنت هذه المرحلة المجهر والمجهر على طاولة الاهتزاز معزولة (Scientifica ، Uckfield ، المملكة المتحدة) لمنع القطع الحركة أثناء التسجيل البصري. ويتم رصد الأنماط الحركية المتولدة في العقدة فموي معدي (STG) باستخدام التسجيلات خارج الخلية 2-4. يتم ذلك من خلال الخطوات التالية : بنيت حجرة الفازلين على أساس أسطواني حول مقطع من العصب المحرك الرئيسي (lvn) لعزل كهربائيا العصبية من حمام (يتم ذلك في مرحلة تشريح قبل يوضع طبق بيتري على منصة تشغيل المجهر التصوير ). يتم وضع واحد من اثنين غير القابل للصدأ أسلاك الفولاذ الكهربائي في هذا الحيز ، والآخر في الحمام باعتباره القطب المرجع. يتم تسجيل إشارة التفاضلية وتصفيتها وتتضخم مع مكبر للصوت التفاضلية AC (جامعة كايزرسلاوترن ، ألمانيا). ورصد النشاط الحركي للعقدة باستخدام الذبذبات (DL708E ؛ يوكوجاوا ، طوكيو ، اليابان) ، وبالإضافة إلى ذلك يتم تسجيلها باستخدام لوحة الحصول على البيانات (الطاقة الكهربائية CED ، 1401 ، كامبردج الالكترونية تصميم ، كامبريدج ، المملكة المتحدة) وسبايك 2 v6.10 البرمجيات (كامبردج الالكترونية تصميم ، كامبريدج ، المملكة المتحدة). ويتم تحليل الملفات باستخدام سبايك 2 v6.10 (كامبردج الالكترونية تصميم ، كامبريدج ، المملكة المتحدة). 2. إعداد محلول الصبغة استخدمنا الفلورسنت الجهد حساسة للصباغة دي – 8 – ANEPPQ (كامبردج العلوم البيولوجية) 5 ، التي لديها تهمة مزدوجة الإيجابي الذي يسهل التحميل من خلال صبغ microelectrodes باستخدام النبضات الايجابية الحالية. وينبغي أن تكون محمية من محلول الصبغة الضوء قدر الإمكان. يتم تحضير محلول الصبغة على النحو التالي : يتم خلط 5 ملغ من الصبغة مع 1 مل من حمض Pluronic F – 127 في الحل (Invitrogen) DMSO. يتم طرد القنينة البلاستيكية التي تحتوي على الصبغة الذائبة لمدة 20 دقيقة في التناوب 12000 / دقيقة في Microcentrifuge سيغما 14/01 (سيغما ، أوسترود ، ألمانيا) في لفصل جزيئات أكبر الصبغة التي قد تسد microelectrode. يتم فصل طاف (أعلى 200 ميكرولتر) من محلول الصبغة باستخدام pipettor وتخزينها في قنينة بلاستيكية منفصلة. يتم التفاف كل من القنينات في رقائق الألومنيوم لمنع التعرض للضوء. يتم تجميد الحل في صبغ -20 درجة مئوية. ذاب قبل استخدام محلول الصبغة عن طريق وضع قنينة مغلقة وملفوفة في الحارة (25 درجة مئوية) الماء لمدة 10-15 دقيقة. 3. صبغ تحميل عن طريق الحقن بين الخلايا باستخدام Microelectrodes شارب استخدمنا microelectrodes حادة لتحميل الخلايا العصبية مع الصبغة. للتحقق من تحميل صبغ نستخدم نظام التصوير MiCAM02 (SciMedia ، طوكيو ، اليابان) 6. نظام التصوير واثنين من كاميرات CCD : الكاميرا الموارد البشرية لديها أكبر شريحة استشعار (6.4 مم × 4.8 مم) وتقديم أفضل قرار المكاني لقرار أفضل الزمنية يجري 1،4 مللي ، والكاميرا HS أصغر (2.9 مم × 2.1 مم) ، ولكن أسرع أسرع رقاقة الاستشعار السماح التصوير وجود 0،7 مللي عن قرارها أفضل الزمانية. خطوات التحميل الصبغة هي كما يلي : يتم سحبها Microelectrodes مع P – 97 يلهب — براون (سوتر الآلات ، نوفاتو ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية) مجتذب الكهربائي باستخدام 10 سنتيمترا ، 1 ملم الزجاج أنابيب قطرها الخارجي مع خيوط (GB100TF 8P ، منتجات العلوم ، Hofheim ، ألمانيا). يتم سحبها الأقطاب لديها مقاومة فيمجموعة من 25-40 MOhm في بوكل 3M (لمناسبة إعدادات المعلمة سحب اتبع هذه التعليمات ماصة التي قدمها صانع مجتذب الكهربائي). الحل صبغ المجمدة المنصهرة وامتص كمية صغيرة جدا منه يصل الى إبرة microfil (MicroFil — 34G ، الآلات الدقيقة العالمي ، ساراسوتا ، فلوريدا ، الولايات المتحدة) — الصبغة امتص حتى يملأ حوالي الثالثة 2 / 3 من الإبرة microfil . يتم حقن محلول الصبغة في إبرة microfil في غيض من microelectrode. يتم وضع microelectrode في مربع مظلم لمدة 15 دقيقة. ويتم ردم microelectrode مع الحل بوكل 3M. ثم يتم وضع مرة أخرى في القطب الكهربائي مربع التخزين مظلمة لمدة دقيقتين 10-20 للسماح للوصول إلى حل صبغ غيض غرامة القطب بواسطة شفط القوة الشعرية التي تعمل في microelectrode. يتم وضع استعداد microelectrode الى صاحب الكهربائي والثابتة على أن headstage من مكبر للصوت داخل الخلايا (IA – 251A ، آلات وورنر ، الشركة هامدين ، CT ، الولايات المتحدة). يتم توصيل مكبر للصوت داخل الخلايا إلى لوحة الحصول على البيانات التي توفر إشارة إلى محرك نبضة نبضة الحالي في microelectrode. يتم وضع microelectrode برفق في غشاء خلية عصبية STG باستخدام تتلاعب microelectrode (PatchStar ، Scientifica المحدودة ، Uckfield ، المملكة المتحدة). منذ المسافة عمل الهدف 10X (UMPLFL10XW ، NA 0.30 WD 3.3mm ؛ الراعون ، طوكيو ، اليابان) للمجهر تصوير صغيرة جدا ، ينبغي وضعه في microelectrode في وضع منحرف (حوالي 30 درجة) والحركة من microelectrode في الموقف الصحيح يتطلب عدة خطوات لإعادة التركيز على الهدف المجهر وتحريك microelectrode. يتم نقل لبدء microelectrode في مثل هذا الموقف أن طرفها فوق STG. الهدف هو خفض المجهر حتى غيض الكهربائي يظهر في التركيز. ثم يتم إنزال أكثر من ذلك بكثير ولكن ليس كما لمس microelectrode. وخفضت microelectrode حتى إعادة يظهر في التركيز على الهدف. وتتكرر هذه الخطوات حتى تظهر بوضوح في الخلايا العصبية في الطائرة التركيز في الهدف. ثم خفضت microelectrode حتى يلمس بلطف ويثقب غشاء الخلية العصبية STG المحدد. ويتم رصد هذه باستخدام الذبذبات. وتستخدم الخلايا القطب لتسجيل نشاط الخلايا العصبية STG المختارة من أجل التعرف على الخلايا العصبية نظرا صورتها النشاط والعلاقة بين نشاطها ونشاط STG المسجلة من القطب 2،3،7 خارج الخلية. تشغيل مكبر للصوت داخل الخلايا إلى وضع الحقن الحالية ويستخدم لمدة 30 دقيقة لحقن 10 NA الخطوات الايجابية الحالية في microelectrode التي تكون مفصولة عن الماضي والثانية 1 1 الفجوات الثاني مع أي حقن الحالي في microelectrode. محركات حقن الحالية الجزيئات المشحونة إيجابيا في صبغ الخلايا العصبية مسجل. إذا قد يكون متوفرا معدات حقن الخلايا العصبية متعددة في وقت واحد. عشر دقائق من بداية فترة الحقن وبعد انتهاء الحقن يتم التحقق من انتشار الصبغة داخل الخلايا العصبية. للقيام بذلك نستخدم نظام التصوير MiCAM02 (SciMedia المحدودة ، طوكيو ، اليابان) مع الهدف 10x والإضاءة من المصدر تموج منخفضة جدا ضوء الهالوجين (HL – 151 ؛ Moritex ، طوكيو ، اليابان) من خلال تصفية MSWG2 مكعب (مع 480-550 نانومتر تصفية الإثارة ؛ الراعون ، طوكيو ، اليابان). تم تعيين نظام التصوير استخدام الكاميرا الموارد البشرية مع 192 × 128 بيكسل ، و 40 مللي وقت التصوير ، صيغة "hbin' ، و 10 لقطة في جلسة التصوير. إذا كان ملء صبغ ناجحا يجب أن تظهر التصوير تصحيحا مصبوغ في الخلايا العصبية في جميع أنحاء موقع microelectrode ، وهذا التصحيح يجب أن ينمو مصبوغ بين الصور التي اتخذت بعد 10 دقائق ، وبعد 30 دقيقة. إذا كان انتشار الصبغة غير كافية بعد 30 دقيقة ، يتم منح مزيد من الوقت الحقن. بدلا من ذلك ، قد يتم استخدام القطب صبغة جديدة. يتم سحبها الكهربائي من الخلايا العصبية وتترك الخلايا العصبية للاسترخاء لمدة 20-30 دقيقة على الأقل. في غضون هذا الوقت ، قد يكون حقن الخلايا العصبية المقبل مع صباغة. 4. التصوير من الخلايا العصبية مصبوغ ولا يمكن تصوير نشاط الخلايا العصبية واحد بعد العملية صبغة التعبئة. بدلا من ذلك قد تكون مليئة اثنين أو أكثر من الخلايا العصبية في صورة نشاط الخلايا العصبية في وقت واحد STG عدة. يمكن من حيث المبدأ أن تملأ العديد من الخلايا العصبية ، وربما جميع STG مع صباغة. يتم التصوير من الخلايا العصبية مع نظام MiCAM التصوير باستخدام كاميرا 02 الموارد البشرية. الإجراء من التصوير هي كما يلي : يتم تغيير الهدف المجهر وانتقال الضوء عالية الكفاءة 20X الهدف (XLUMPLFL20XW/0.95 ، NA 0.95 ، WD 2.0mm ؛ الراعون ، طوكيو ، اليابان) وتستخدم لجمع البيانات التصوير. يجمع هذا الهدف أكثر من ذلك بكثير ضوء أن الهدف 10x ويعطي أيضا أعلى التكبير تقديم صورة أكثر تفصيلا من الخلايا العصبية. Bein ز يعني أكثر كفاءة ضوء ذلك كمية صغيرة من الصبغة تحميل غير مرئية بالفعل مع هذا الهدف ، وأيضا أن نتمكن من استخدام أقل شدة الضوء للتصوير الحد من الأضرار المحتملة التي قد الصورة أن يكون سبب في الخلايا العصبية التي صباغة. تم وضع المرحلة المجهر التشغيل مثل هذه الخلايا العصبية التي من المفترض أن تكون هي المصورة في مجال الرؤية والهدف وتركز على الهدف منها. يتغذى أيضا على تسجيل البيانات في التصوير خارج الخلية MiCAM النظام من خلال 02 قناة في مدخلات تناظرية. هذا يسمح للمن السهل نسبيا المتعلقة الإشارات الضوئية والأنماط الحركية المقابلة المسجلة خارج الخلية أو المسامير في مرحلة التحليل. تم تعيين 02 MiCAM نظام لاستخدام 96 × 64 بيكسل مع 2.2 مللي وقت التصوير أو 48 × 32 بيكسل مع 1.5 مللي وقت التصوير. في كلتا الحالتين قد تكون استخدمت "hbin' تحديد إذا صبغ الخلايا العصبية ليست قوية جدا. يتم تعيين مستوى الضوء عند أدنى مستوى ممكن (أي الصبغة في الخلايا العصبية لا يزال ينبغي أن تولد ما يكفي لمضان التصوير) لتجنب الضرر وتعديل الصورة صورة للعصبونات مسجل. يتم تشغيل إضاءة الغرفة وجميع مصادر الضوء المتبقية قبالة. بالإضافة ، قد تكون مغلقة ستارة سوداء حول تلاعب في تسجيل لمنع التعرض للضوء من مصادر خارجية. يتم تعيين جلسات التصوير لتكون بين 4 — 16 ثانية طويلة. يتم تسجيل نشاط الخلايا العصبية التلقائية للمصبوغ عبر دورات التصوير عدة. 5. تحليل بيانات التصوير الضوئي لتحليل البيانات التصوير استخدمنا برنامج BVAna (الإصدار 10.08 ؛ SciMedia المحدودة ، طوكيو ، اليابان) المرتبطة بنظام التصوير MiCAM 02. البرنامج يدعم التصور للبيانات التصوير ويوفر مجموعة واسعة من أدوات التحليل كذلك. خطوات تحليل البيانات وتفسيرها على النحو التالي : تم اختيار منطقة مناسبة التعميم الفائدة على كل الخلايا العصبية مسجل. عادة ما نستخدم 2-3 المناطق بكسل الفائدة نصف قطرها عن التحقيق في الخلايا العصبية في القرار × 48 بكسل 32 ، و 6 — 8 مناطق القطر بيكسل ذات الاهتمام عن التحقيق في الخلايا العصبية في 96 القرار 64 س. قد تجانس الزمني للبيانات أمرا ضروريا ، خصوصا إذا كانت الصبغة يولد كمية قليلة نسبيا من مضان (القيمة خلفية منخفضة في هذه البيانات تشير ، بل قد يكون راجعا إلى مستوى الإضاءة الخافتة التي يتم استخدامها أو انخفاض مستوى شحن الصبغة ، على سبيل المثال في neurite من الخلايا العصبية مسجل). عادة في مثل هذه الحالات كنا تجانس مع الزماني 3 — 5 وحدات الوقت. بالإضافة إلى التسجيلات البصرية ونحن أيضا عرض تسجيل خارج الخلية من خلال تحديد لعرض المدخلات التناظرية نظام التصوير. يجب تعيين المعلمات من أجل تصور من البيانات البصرية والمدخلات التناظرية بشكل مناسب من أجل أن نرى جميع التسجيلات على شاشة الكمبيوتر. النظر في التسجيلات البصرية من الخلايا العصبية ، وتسجيل من خارج الخلية lvn ، وتصنيف من الخلايا العصبية على أساس تسجيل في وقت سابق بين الخلايا ، فمن الممكن أن يتم تحديد هوية من الخلايا العصبية وربط نشاطها إلى أنشطة العصبية المسجلة من العصبية. ومن المتوقع أن تظهر بوضوح التسجيلات البصرية ، ودون الحاجة ليبلغ أكثر من أحداث مماثلة عدة ، والأنشطة العصبية المقابلة لالتموج سجلت خارج الخلية ، وكذلك الأحداث دون العتبي مثل إمكانات بعد متشابك المثبطة الناجمة عن نشاط الخلايا العصبية الأخرى يمكن استخدام ميزات تصدير البيانات من البرنامج BVAna لتصدير التسجيلات البصرية تحسب لمناطق مختارة من الاهتمام وأيضا مدخلات تناظرية الذي يحتوي على تسجيل من lvn. ويمكن معالجة البيانات التي تم تصديرها وتحليلها باستخدام مزيد من البرامج الأخرى لتحليل البيانات وكذلك (على سبيل المثال في أبسط الحالات قد يتم استخدام مايكروسوفت اكسل (مايكروسوفت ، ريدموند ، واشنطن ، الولايات المتحدة) لرؤية إضافية وتجهيز البيانات). 6. ممثل النتائج ويبين الشكل 2 تسجيل الخلايا العصبية في وقت واحد من اثنين (ليرة لبنانية ، الوحشي البواب عصبون ؛ PD ، البواب موسع الخلايا العصبية) في مولد النمط المركزي البواب من سلطعون STG مع تسجيل من lvn. التسجيلات البصرية من الخلايا العصبية ليرة لبنانية وPD حددت على أساس تسجيلاتهم داخل الخلايا بالفعل تبين أن هذه المباراة بشكل جيد مع تسجيلات خارج الخلية العصبية المقابلة ليرة لبنانية والمشتريات. هناك تأخير متسقة بين 12 مللي التسجيلات البصرية والحدود القصوى للارتفاع lvn (انظر أقحم في الشكل 2) ، نظرا لتأخر انتقال محواري بين العقدة وتسجيل موقع خارج الخلية. البيانات المقدمة تبين أيضا أن النشاط العصبي في سوما الذي يتوافق مع طفرات في الخلايا العصبية المسجلة للكشف بشكل واضح. s/ftp_upload/2567/2567fig1.jpg "بديل =" الشكل 1 "/> الشكل 1. رسم بياني) تخطيطي للجهاز العصبي فموي معدي (STNS). COG ، العقدة صواري ؛ OG ، العقدة المريء ؛ STG ، العقدة فموي معدي ؛ STN ، العصب فموي معدي ؛ lvn ، البطين الوحشي العصب. B) والعقدة فموي معدي السلطعون (STG) — صورة يبين ترتيب الهلالية الخلفي من الخلايا العصبية STG. الشكل 2. الفورية واحد من الاجتياح تسجيل المشتريات والخلايا العصبية ليرة لبنانية مع تسجيل للlvn. وتوضح البيانات أن تلك التسجيلات البصرية والعصبية المباراة بشكل جيد للغاية وأننا قادرون على التعرف على الأنشطة العصبية المقابلة ليسجل طفرات تشكل العصب. وأقحم يظهر تراكب عدة مداهمات من امكانات العمل ليرة لبنانية — سواء بصريا وسجلت كهربائيا — ومتوسط بهم مما يدل على تطابق بين بصريا وأنشطة سجلت كهربائيا. يرجع ذلك إلى حقيقة أن لدينا وسيلة تسجيل البصرية لا تصفية عناصر الترددات المنخفضة من البيانات ونحن أيضا قادرين على تسجيل بطء التغييرات المحتملة غشاء الخلايا العصبية المميزة ليرة لبنانية وPD 14.
Discussion
الصبغة الحساسة الجهد التصوير 8،9 STG من الخلايا العصبية في تركيبة مع الأساليب التقليدية الكهربية (التسجيلات الكهربائي داخل وخارج الخلية) تتيح تحسين فهم كيفية عمل هذه الصغيرة ، معروفة ومعقدة لا يزال يعمل النظام العصبي. وSTG هي نموذج للنمط الشبكات المركزية (CPG) مولد العصبية (وهو يتضمن إيقاع طاحونة البواب في المعدة والشبكات) 10 ، و 11 ، وبالتالي فهم أفضل للخصائص الوظيفية للSTG الناشئة سوف تساعد أيضا على فهم كيفية بصفة عامة CPG شبكات توليد وظائفها مستوى الشبكة. CPG شبكات تلعب دورا حاسما في التحكم في المحركات ، وكذلك 12 في وظائف الادراك العالي 13 ، وبالتالي قد يكون فهم أفضل لممتلكاتهم الناشئة يكون لها تأثير كبير في كثير من مجالات علم الأعصاب.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نعترف الدعم المقدم من كلية علوم الحاسبات وكلية العلوم والزراعة والهندسة في جامعة نيوكاسل ، من جامعة أولم ، والتي SciMedia المحدودة (طوكيو ، اليابان).
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| MiCAM02 | SciMedia Ltd, Tokyo, Japan | Imaging system | ||
| BVAna v.10.08 | SciMedia, Tokyo, Japab | Data analysis software for the MiCAM 02 imaging system | ||
| HL-151 | Moritex, Tokyo, Japan | Ultra-low ripple halogen light source | ||
| BX51 WI | Olympus, Tokyo, Japan | Upright microscope for epifluorescence imaging | ||
| 20x imaging objective | Olympus Corporation, Tokyo, Japan | XLUMPLFL20XW/0.95 | NA 0.95, WD 2.0mm | |
| 10x imaging objective | Olympus Corporation, Tokyo, Japan | UMPLFL10XW | NA 0.30, WD 3.3mm | |
| Filter cube with 480-550 nm excitation filter and 590nm emission filter | Olympus Corporation, Tokyo, Japan | MSWG2 | ||
| Antivibration table | Scientifica Ltd, Uckfield, UK | 63-534 | ||
| PatchStar electrode manipulator | Scientifica Ltd, Uckfield, UK | PS-7000C | Micro-electrode manipulator | |
| CED Power 1401 | Cambridge Electronic Design, Cambridge, UK | Data acquisition board | ||
| DL708E Oscilloscope | Yokogawa, Tokyo, Japan | Intracellular amplifier | ||
| AC differential amplifier | University of Kaiserslautern, Germany | Extracellular amplifier | ||
| P-97 Flaming – Brown type electrode puller | Sutter Instruments, Novato, CA, USA | Electrode puller | ||
| Sigma Microcentrifuge 1-14 | Sigma, Osterode, Germany | Centrifuge | ||
| Genex Pipettors Mline | Scientific Laboratory Supplies, UK | PIP7774 | PIP7774 | |
| Glass micropipette with filament | Science Products, Hofheim, Germany | GB100TF 8P | Glass for microelectrodes | |
| MicroFil – 34G | World Precision Instruments, Sarasota, FL, USA | Microfil needle | ||
| Spike 2 v6.10 | Cambridge Electronic Design, Cambridge, UK | Electrophysiology software | ||
| Di-8-ANEPPQ | Cambridge Bioscience Ltd, Cambridge, UK | BT61014 | Fluorescent voltage sensitive dye | |
| F-127 Pluronic Acid, DMSO | Invitrogen, Paisley, UK | P-3000MP | Solvent | |
| NaCl | Sigma – Aldrich, Poole, UK | S9888 | Crab saline component | |
| CaCl2 . 2H2O | Sigma – Aldrich, Poole, UK | C3881 | Crab saline component | |
| KCl | Sigma – Aldrich, Poole, UK | P3911 | Crab saline component, electrolyte solution | |
| MgCl2 . 6H2O | Sigma – Aldrich, Poole, UK | M9272 | Crab saline component | |
| Trizma base | Sigma – Aldrich, Poole, UK | T1503 | Crab saline component | |
| Maleic acid | Sigma – Aldrich, Poole, UK | M0375 | Crab saline component | |
| Elastosil RT-601 | Wacker, Munich, Germany | Lining of Petri dishes |
References
- Gutierrez, G. J., Grashow, R. G. Cancer borealis stomatogastric nervous system dissection. J Vis Exp. , (2009).
- Bartos, M., Nusbaum, M. P. Intercircuit control of motor pattern modulation by presynaptic inhibition. J. Neurosci. 17, 2247-2256 (1997).
- Blitz, D. M., Nusbaum, M. P. Motor pattern selection via inhibition of parallel pathways. J Neurosci. 17, 4965-4975 (1997).
- Stein, W., Smarandache, C. R., Nickmann, M., Hedrich, U. B. Functional consequences of activity-dependent synaptic enhancement at a crustacean neuromuscular junction. J Exp Biol. 209, 1285-12300 (2006).
- Loew, L. Potentiometric dyes: Imaging electrical activity of cell membranes. Pure & Appl Chem. 68, 1405-1409 (1996).
- Tominaga, T., Tominaga, Y., Yamada, H., Matsumoto, G., Ichikawa, M. Quantification of optical signals with electrophysiological signals in neural activities of Di-4-ANEPPS stained rat hippocampal slices. J Neurosci Meth. 102, 11-23 (2000).
- Heinzel, H. G., Weimann, J. M., Marder, E. The behavioral repertoire of the gastric mill in the crab, Cancer pagurus: an in situ endoscopic and electrophysiological examination. J Neurosci. 13, 1793-1803 (1993).
- Zecevic, D., Wu, J. -. Y., Cohen, L. B., London, J. A., Höpp, H. P., Falk, C. X. Hundreds of neurons in the Aplysia abdominal ganglion are active during the gill-withdrawal reflex. J Neurosci. 9, 3681-3689 (1989).
- Briggman, K. L., Kristan, W. B. Imaging dedicated and multifunctional neural circuits generating distinct behaviors. J Neurosci. 26, 10925-10933 (2006).
- Nusbaum, M. P., Beenhakker, M. P. A small-systems approach to motor pattern generation. Nature. 417, 343-350 (2002).
- Marder, E., Bucher, D. Understanding circuit dynamics using the stomatogastric nervous system of lobsters and crabs. Ann Rev Physiol. 69, 291-316 (2007).
- Grillner, S. Biological pattern generation: the cellular and computational logic of networks in motion. Neuron. 52, 751-766 (2006).
- Yuste, R., MacLean, J. N., Smith, J., Lansner, A. The cortex as a central pattern generator. Nat Rev Neurosci. 6, 477-483 (2005).
- Stein, W. Modulation of stomatogastric rhythms. J Comp Physiol A. 195, 989-1009 (2009).
Tags
Optical ImagingNeuronsCrab Stomatogastric GanglionVoltage-sensitive DyesMethodologyNeuronal NetworksSimultaneous ActivityIntegral FunctionalityNetwork OrganizationPattern Generating NeuronsFluorescent Voltage-sensitive DyeDi-8-ANEPPQMiCAM02 High Speed And High Resolution CCD Camera Imaging SystemBVAna Imaging SoftwareElectrophysiology TechniquesCentral Pattern Generator Neural Networks
Cite This Article
Stein, W., Städele, C., Andras, P. Optical Imaging of Neurons in the Crab Stomatogastric Ganglion with Voltage-sensitive Dyes. J. Vis. Exp. (49), e2567, doi:10.3791/2567 (2011).