Expansion, purification et d'évaluation fonctionnelle des cellules NK humaines périphérique Sang

1. Isolation des PBMC de Buffy Coat Cellules mononucléées du sang périphérique (PBMC) sont obtenues par centrifugation sur la densité de flottaison Ficoll-Paque d'échantillons de donneurs sains couche leuco-dérivé par cytaphérèse. La centrifugation Ficoll-Paque est faite selon le protocole du fabricant avec des modifications mineures. Ajouter PBS pour un donneur normal-banque de sang buffy coat à un volume final de 140 ml (typique du volume buffy coat est de 40-70 ml). Couche 35 ml d'échantillon sur la couche leuco-15 ml de Ficoll-Paque (4 tubes). Centrifuger à 400g pendant 20 minutes sans frein. Récupérer les PBMC du Ficoll-Paque: interface plasma, ne jetez pas les globules rouges au bas de l'Ficoll-Paque. Lavez PBMC trois fois avec PBS, centrifugation à chaque fois à 400g pendant 10 minutes. PBMC peuvent être utilisés directement pour l'expansion des cellules NK à ce stade ou les cellules NK peuvent être isolées par RosetteSep (section 4) PBMC restantes peuvent être congelés dans FBS contenant 10% de DMSO dans l'azote liquide. Aspirer le Ficoll et de recueillir les globules rouges de l'étape 5 en deux 50 ml tube de centrifugeuse, laver trois fois avec du PBS (ajouté à 50 ml marque), chaque fois aspirer le surnageant écrémage au sommet de la couche de RBC pour enlever les granulocytes. Les globules rouges peuvent être utilisées immédiatement pour RosetteSep  purification des cellules NK (se référer à la section 4) ou stockées dans un volume égal de solution d'Alsever à 4 ° C pour une utilisation ultérieure (Les globules rouges peuvent être enregistrer pour un maximum de 4 semaines). 2. L'expansion des cellules NK L'expansion des cellules NK peuvent être initiées en utilisant PBMC ou cellules NK purifiées. Le montant des PBMC utilisé pour l'expansion peut être modifiée en fonction de la quantité de cellules NK souhaité à la fin d'une expansion de trois semaines, se référer à des résultats représentatifs pour les détails. (Voir Note 1) STIMULATION 1 Jour 0 Pour chaque 6 5×10 PBMC d'être élargi, de comptage et d'irradier 10×10 6 K562 CL9 mIL21 l'aide d'un irradiateur gamma à 100 Gy. Post-irradiation, laver les cellules avec du PBS et remettre en suspension dans l'expansion des cellules NK médias (Nkem). Graine 5×10 6 PBMC par 10×10 6 irradiés K562 CL9 mIL21 (1:2) dans 40 ml de Nkem dans un flacon T75 et le placer en position verticale dans une étuve à 37 ° C et CO 2 5%. Jours 3 et 5 Récupérer les cellules par centrifugation à 400g pendant 5 minutes et remplacer la moitié des médias avec Nkem frais (ajouter IL2 frais pour l'ensemble du volume des médias) et continuer la culture. STIMULATION 2 Jour 7 Comptez le nombre de cellules en culture, à la fin d'une semaine. Mettez de côté 5×10 5 cellules pour le phénotypage en cytométrie en flux (voir note 2) Pour chaque 6 5×10 cellules pour être restimulées, compter et irradient 5×10 6 K562 CL9 mIL21 l'aide d'un irradiateur gamma à 100 Gy. Ajouter un nombre égal de irradié K562 CL9 mIL21 (1:1) et remettre en suspension dans Nkem au 2.5×10 5 cellules totales / ml (voir note 3). Semences dans les cellules flacons T75 (maximum 50 ml par flacon). Jours 10 et 12 Comptez le nombre de cellules. Changer ensemble des médias avec les Nkem frais basé sur le nombre de cellules (voir note 3). Jour 14 A la fin de deux semaines de l'expansion de compter le nombre de cellules en culture. Mettez de côté 5×10 5 cellules pour le phénotypage en cytométrie en flux (voir note 2) Si l'expansion a commencé à partir de PBMC les cellules NK peuvent être purifiées à ce stade de l'expansion en utilisant le protocole de purification RosetteSep (se référer à la section IV). Si l'expansion a commencé à partir de cellules NK purifiées procéder à une stimulation 3. Après purification mis de côté 5×10 5 cellules pour le phénotypage en cytométrie en flux pour vérifier la pureté des cellules NK (comme dans l'étape 8). Procéder à la stimulation 3 en utilisant l'ensemble des cellules NK purifiées (voir note 4). STIMULATION 3 Resuspendre les cellules NK avec irradiés K562 CL9 mIL21 (1:1) dans Nkem basée sur le nombre de cellules (voir note 3). Jours 17 et 19 Comptez le nombre de cellules. Changer médias avec Nkem frais se basant sur le nombre de cellules (voir note 3). Jour 21 Au bout de trois semaines de l'expansion de compter le nombre de cellules en culture. Récupérer 1×10 6 cellules pour une analyse de cytométrie en flux pour le panneau de cellules NK pleine d'anticorps phénotypage (voir tableau 1). Gel dans les cellules SVF contenant du DMSO 10% à une densité maximum de 5×10 7 cellules par flacon pour une utilisation future. 3. Assay NK cytotoxicité cellulaire Décongelez un flacon de cellules NK et les semences dans Nkem, un jour avant performing test de cytotoxicité pour permettre la récupération. Pour chaque test de cytotoxicité des cellules NK en utilisant une ligne seule cible cellulaire, 6×10 5 cellules NK et 3×10 5 cellules cibles sont nécessaires (voir note 5). Préparer CAM-Media en diluant calcéine-AM (stock 1 mg / ml dans le DMSO) dans Nkem (voir note 6). Resuspendre 10 6 cellules cibles dans 1 ml de CAM-médias (voir note 7). Incuber pendant 1 h à 37 ° C, avec agitation occasionnelle. Resuspendre les cellules NK au 1×10 6 cellules / ml et ajouter 200uL de suspension de cellules NK à chacun des 3 puits d'un U-96 puits à fond plat à 10 correspondants: 1 rapport E: T de la figure 1. (Voir note 8) Ajouter 100 ul de milieu complet à tous les puits restants à l'exception des "maximum". Ajouter 100 ul de 2% de Triton X-100 à "maximum". Effectuer des dilutions en série des cellules NK pour le E 5 ultérieurs: les ratios T en transférant 100 ul de cellules à chaque fois, bien mélanger. Jeter 100ul du dernier puits (rapport E: T de 0.3125:1). Après 1 heure de chargement calcéine, laver les cellules cibles dans Nkem deux fois, la centrifugation pendant 5 min à 1200 rpm. (Voir note 9) Re-compter les cellules cibles et remettre à 1×10 5 cellules / ml. Ajouter 100 ul de cellules cibles dans chaque puits (1×10 4 / puits). Centrifuger 1 min à 100g à initier un contact cellulaire. Incuber à 37 ° C et 5% de CO 2 pendant 4 heures. Mélanger délicatement la culture par pipetage avec un pipetteur 100 pL afin d'uniforme suspendre la calcéine libérée, ralentit plaque à 100g pendant 5 minutes pour sédimenter les cellules et transférer 100 ul du surnageant d'une nouvelle plaque en prenant soin d'éviter les bulles. Pop les bulles qui peuvent se former en utilisant une aiguille fine. Lire la plaque à l'aide d'un lecteur de plaque fluorescente (filtre d'excitation 485 nm, filtre d'émission 530 nm). Lire Bas est recommandée. Calculer pourcentage de lyse spécifique en fonction de la formule [(version version-test de spontanée) / (libération maximale – libération spontanée)] x 100. 4. Purification des cellules NK par RosetteSep Prenez 100 fois plus de globules rouges à celui des PBMC ou des cellules élargi, dans un tube de 50 ml (100:1 RBC: PBMC). Si vous utilisez les globules rouges fraîches procéder directement à l'étape suivante ou si les globules rouges ont été entreposés dans une solution d'Alsever s, compter le nombre de globules rouges et de lavage approprié (100 excès de pli) quantité de globules rouges avec du PBS supplémenté avec 2% de FBS à trois reprises, la centrifugation à 1200 rpm pendant 10 minutes chaque fois. Combinez les globules rouges avec des PBMC de l'étape 1.7 ou cellules élargi de l'étape 2.10 en PBS + 2% de FBS à un volume final de 1 mL par 5×10 7 cellules de PBMC ou élargi. Ajouter 1 microlitre d'RosetteSep  Cocktail homme NK enrichissement cellulaire par 1×10 6 cellules de PBMC ou élargi. Bien mélanger et incuber à température ambiante pendant 20 minutes avec mélange en douceur toutes les 5 minutes. Ajouter un volume égal de PBS + 2% SVF mélangez délicatement et la couche sur le dessus du Ficoll-Paque. Répétez les étapes de centrifugation sur Ficoll-Paque décrit pour l'isolement des PBMC (Section I). Compter les cellules NK récupéré après purification et mis de côté 5×105 cellules pour phenotpying par cytométrie en flux pour la pureté des cellules NK (étape 8). 5. Remarques NOTE 1. Cellules NK peut être étendu directement à partir de PBMC, ou à partir de cellules RosetteSep  NK purifiées. Nous avons noté l'efficacité expansion similaire, mais certains donateurs peuvent avoir très faible nombre de cellules NK dans la purification résultant difficulté par RosetteSep avant l'expansion. NOTE 2. Nous utilisons régulièrement CD56-FITC, CD16-PE, et CD3-PE-Cy5 pour le phénotypage pendant l'expansion, énumérant les cellules NK comme ceux qui sont CD3-CD16-négatives et ou CD56-positives. NOTE 3. A chaque changement de support ou de stimulation, remettre les cellules à 2,5 x 10 5 / ml pour maintenir le nombre de cellules PBMC / NK à ou moins de 2 millions par ml à des stades de pointe de l'expansion. Cela permettra d'éviter l'épuisement des nutriments et aider à réaliser l'expansion maximale et de survie. NOTE 4. Le taux d'expansion NK est dépendante des donateurs et à la fin des stimulations 1 ou 2 une partie des cellules peuvent être congelées et une partie encore élargi en fonction de la nécessité d'expérimentation. Nous avons eu un bon succès dans l'utilisation des cellules congelées pour des extensions à une date ultérieure. NOTE 5. Afin de permettre à l'erreur, nous vous recommandons d'utiliser un minimum de 7×10 5 cellules NK remis en suspension dans 700 ULS du Nkem et 4×10 5 calcéine-AM cellules cibles teinté remis en suspension dans 4 ml de Nkem de mise en place du test de cytotoxicité. Si vous utilisez pipette multicanaux pour l'ensemencement des cellules cibles des volumes plus élevés de cellules (jusqu'à 6×10 5 à 6 ml) peuvent être nécessaires en fonction de la taille du bassin de média utilisé. Aussi le nombre des cellules NK sont recommandées spécifiquement pour le E: T ratios montrent dans le protocole, pour l'utilisation de plus E: T ratios augmententle nombre des cellules NK par mL en conséquence (par exemple pour un e 40:1: 4×10 T utilisent ratio de 6 cellules / ml) NOTE 6. Nous vous recommandons d'effectuer au préalable calcéine-AM de chargement de titrage pour la lignée cellulaire cible de choix, en utilisant les dilutions suivantes de 1:500, 1:400. 1:300, 1:200 et 1:100 pour obtenir la différence entre la libération optimale maximale et spontanée. NOTE 7. Lorsque vous utilisez une ligne de cellules adhérentes comme cible, d'abord préparer la suspension cellulaire unique à l'aide non-enzymatique des cellules tampon de dissociation. Si vous effectuez l'ADCC, de préparer un tube double de cellules cibles dans CAM-médias. NOTE 8 Si vous effectuez l'ADCC, ajouter mêmes cellules NK à 3 puits correspondant à 10h01 E:. T pour l'ADCC. Répétez l'opération pour les bailleurs de fonds supplémentaires. Répétez l'opération pour les cellules cibles supplémentaires. NOTE 9. Si vous effectuez une expérience ADCC, après 45 minutes de chargement calcéine, ajouter 10ug d'anticorps spécifiques pour induire l'ADCC contre les cellules cibles. Après 15 minutes de plus, se laver les cellules cibles dans un milieu complet à deux reprises, la centrifugation pendant 5 min à 1200 rpm. Resuspendre les cellules à 1×10 5 cellules / ml et procéder à l'étape suivante dans le protocole. 6. Les résultats représentatifs Figure 2. Lorsque l'expansion est réalisée selon le schéma décrit ci-dessus, en utilisant 5×106 PBMC comme matériau de départ, typiques des cellules NK large rendements de 1×10 9 au 10 oct cellules (variabilité dépendante des donateurs). La figure montre l'expansion des cellules NK fois (n = 19) par rapport aux cellules NK présentes dans le produit original (médiane + / – quartile). Figure 3. Les cellules NK expriment élargi différents récepteurs des cellules NK qui sont comparables à la non expansées primaires des cellules NK à quelques exceptions près (CD11b, CD160 et CD244). Figure 4. Récupération PBMC de Buffy manteau est dépendante des donateurs et peut aller de 6 à 300×10 800×10 6. Les cellules NK peuvent comporter de 2% – 18% des PBMC. Pour la purification des cellules RosetteSep élargi, la récupération des cellules NK pures au jour 14 varie de 40-70%. En suivant le protocole recommandé d'expansion et de la purification, la pureté des cellules NK de 99% peut être attendue. Figure 5. Élargi les cellules NK ont démontré une cytotoxicité contre une gamme de lignées cellulaires tumorales, y compris le neuroblastome, le LAM, l'ostéosarcome et le mélanome (représentant AML tuant montré que la lyse pour cent spécifiques).