Nanoart de fabrication 1. Nanoart Mouture humide par NETZSCH Méthodes MicroCer Peser les cristaux de drogue et divers tensio-actifs qui seront utilisées pour rendre le nanoformulations utilisant une balance analytique et les mélanger avec tampon Hepes 10 mM, pH 7,8 en utilisant un T-18 mélangeur Ultraturrax jusqu'à dispersion complète. Le pour cent de la drogue dans la formulation doit être compris entre 1 – 2%. Pour le fraisage en continu, assurez-vous que le refroidisseur et le compresseur est en marche. La pression de sortie doit être autour de 100 PSI avant de commencer à moulin à votre échantillon. Allumez l'unité de contrôle et faites tourner le réservoir de broyage afin que les médias de meulage peuvent être chargées dans le réservoir. Ajouter 50 ml de billes dans la chambre de broyage à l'aide d'un entonnoir. Assurez-vous qu'il n'ya pas de perles dans les discussions ou n'importe où en dehors de la chambre de broyage pour éviter les fuites dans la garniture mécanique. Assurez-vous que le joint torique est à sa place sur la chambre de broyage. Sélectionnez une taille d'écran appropriée filet et utiliser l'ensemble du couvercle approprié et sécurisé les couvercles en serrant les écrous. Le maillage d'écran doit être au moins la moitié de la taille des billes. Utiliser une taille d'écran de grandes mailles pour éviter le produit de colmatage du filtre lors du fraisage en continu. Abaissez la chambre de broyage pour la rendre horizontale à l'aide du bouton prévu sur le dessus de la chambre et assurez-vous que le vide produit sortie du tube dans le récipient collecteur. Ajouter la suspension de drogue avec diverses quantités de surfactants pour l'entrée du produit. Le volume minimum de la suspension devrait être de 100 ml. Cela permettra d'éviter la chambre de broyage de la surchauffe et aussi d'éviter la contamination due à billes moins d'usure sur les pièces Démarrer la pompe en utilisant l'unité de contrôle. Le débit peut être modifié au besoin pour votre préparation (~ 50 – 150 mL / min). Tournez l'agitateur et réglez la vitesse sur l'unité de contrôle. La vitesse peut être augmentée de 620 rpm à 4320 rpm sur un MicroCer. Surveiller la température en utilisant la jauge de température qui est attaché sur le dessus de la chambre de broyage et assurez-vous qu'il n'ya pas de surchauffe. Moulin de l'échantillon à différentes vitesses et débits et sortir de petites fractions (~ 1 ml) de la formulation des mesures de taille et de charge en utilisant une diffraction Light Scattering Brookhaven Zetasizer (tableau 1). Après la taille désirée est obtenue, arrêter le fraisage en utilisant l'unité de contrôle. Avec la pompe toujours sur, prélever l'échantillon dans un flacon. Laissez le médicament pour vider complètement dans la fiole de prélèvement. Eteindre la pompe. Pour enlever les perles, placer un bac de récupération sous l'unité. Desserrer les écrous sur la plaque frontale de l'assemblage du couvercle et de recueillir les perles dans le bac. Enlever la plaque avant et utiliser une bouteille d'eau déminéralisée pour laver les billes dans le plateau. Transférer la suspension broyée dans des tubes de 50 ml centrifugeuse et mettre la centrifugeuse à 10.000 tours par minute (10 174 RCF) pendant 30 minutes. À la fin du cycle de centrifugation, de mesurer la quantité de surnageant et le remplacer par la même quantité de solution de tensioactif frais. Une fois la remise en suspension est terminée, le transfert de la suspension à la chambre de broyage et de l'usine pendant 10 minutes. Prélever une partie aliquote (~ 1 ml) et de mesurer la taille et la charge de l'échantillon à l'aide du Zetasizer (tableau 1). Effectuer un nettoyage après utilisation de la MicroCer utilisant de l'eau déminéralisée et 70% d'éthanol. Mesurer la concentration des formulations Nanoart par HPLC. Dans notre cas, nous avons évalué les échantillons par HPLC phase inverse en utilisant triple 20 uL injections sur une colonne C8 YMC Octyl (Waters Inc, Milford, MA) avec une cartouche C8 garde. La phase mobile composée d'acétonitrile 48% / 52% 25 mM KH 2 PO 4, pH 4,15 est pompé à 0,4 ml / min avec détection UV / VIS à 272 nm. Pour toutes les mesures de drogue, la quantification est déterminée par comparaison à une courbe standard de chaque médicament libre (0.025 à 100 pg / ml) préparée dans le méthanol. 2. Homogénéisation Nanoart utilisant le Avestin EmulsiFlex C5 Mesurer les cristaux de drogue et divers tensio-actifs qui seront utilisées pour rendre le nanoformulations utilisant une balance analytique et les mélanger avec tampon Hepes 10 mM, pH 7,8 en utilisant un T-18 mélangeur Ultraturrax pour obtenir une dispersion complète. Transférer la suspension dans la cuve d'homogénéisation et commencer à recirculation. Assurez-vous que le refroidisseur est sur avant de commencer à homogénéiser l'échantillon Augmenter la pression graduellement jusqu'à ce que le compteur affiche 20 000 ± 2000 psi et continuent à homogénéiser jusqu'à la taille des particules cible est atteint. Cela prend généralement entre 45 – 60 minutes. Prélever une partie aliquote (~ 1 ml) de façon périodique et mesurer la taille et la charge de l'échantillon en utilisant un Zetasizer (tableau 1). Transférer la suspension homogénéisée de l'homogénéiseur à 50 tubes à centrifuger ml et mettre la centrifugeuse à 10.000 tours par minute (10 174 RCF) pendant 30 minutes. À la fin dule cycle de centrifugation, de mesurer la quantité de surnageant et le remplacer par un volume égal de solution de tensioactif frais. Après remise en suspension, le transfert à la suspension de l'homogénéisateur C5. Redémarrez la circulation et le retour de la pression d'homogénéisation à 20.000 ± 2.000 psi et homogénéiser pendant 30 minutes. Mesurer la taille et la charge de la formulation utilisant le Zetasizer (tableau 1). Effectuer le nettoyage poste de l'unité avec de l'eau déminéralisée et d'éthanol comme solvant. Mesurer la concentration des échantillons par HPLC. 3. Sonication en utilisant le processeur Parmer Cole ultrasons Mesurer 50 mL de dichlorométhane dans un bécher de verre. Mesure 6 g de poly (lactique-co-acide glycolique) (PLGA) en utilisant la balance analytique, ajouter à du dichlorométhane, et mélanger jusqu'à dissolution complète est observée. Mesure 1,25 g de cristaux de drogue et l'ajouter à la dichlorométhane / solution PLGA. Mélangez pour obtenir une dissolution complète. Faire 1% d'alcool de polyvinyle tensioactif solution (PVA) et le refroidir en utilisant un bain de glace. Assurez-vous que la solution de tensioactif se refroidir avant l'ajout de la solution organique qui contient le médicament dissous. Verser la solution médicamenteuse dans la solution de tensioactif PVA 1% et démarrer le ultrasonicator à une amplitude de 50%. Assurez-vous que la solution tensio-actif est placé dans un bain de glace. L'amplitude de la sonicateur peut être réduite à l'amplitude ~ 30% pour les petits lots d'échantillons. Soniquer l'échantillon pendant 10 minutes. Prenez une petite aliquote (~ 1 ml) pour l'analyse granulométrique (tableau 1). Si la taille des particules est supérieure à 1,5 um, soniquer l'échantillon à intervalles de 2 minutes jusqu'à un maximum de 16 minutes au total. Observez les échantillons au microscope à 20x et documenter les observations (figure 1A). Utiliser une plaque d'agitation à créer un vortex adéquate pour la suspension restant et continuer à mélanger la nuit à température ambiante. Peser 8 g de mannitol dans un flacon et ajouter 80 ml d'eau RO. Mélanger jusqu'à dissolution complète est observée et stocker à température ambiante. Il sera utilisé pour la remise en suspension après centrifugation si les échantillons doivent être lyophilisés. Recueillir la suspension après 24 heures et verser dans des tubes de 50 ml centrifugeuse. Centrifuger les échantillons à une vitesse de 8000 rpm pendant 20 minutes à 5 ° C. Décanter le surnageant et remettre la moitié de l'échantillon dans 75 ml d'osmose inverse filtrée (RO) de l'eau et l'autre moitié dans 75 ml de bromure de triméthylammonium 0,5% cétylique (CTAB) tensio-actif. Centrifuger les échantillons à nouveau à une vitesse de 8000 rpm pendant 20 minutes à 5 ° C et remettre chacune des boulettes avec un total de 20 ml de solution de mannitol. Après la remise en suspension secondes, mesurer la taille des particules à l'aide du Zetasizer (tableau 1). Utiliser des flacons de transfert adéquat pour la suspension restantes et les placer dans le lyophilisateur. Mesurer la concentration des échantillons par HPLC. 4. Morphologie Nanoart Prenez la suspension Nanoart et brièvement soniquer à une amplitude de 20% pendant 5 secondes avec une sonde de sonication. Transférer 10 ul de la suspension dans 1,5 ml d'eau RO dans un tube 1,7 ml et centrifuger vortex pendant 10 secondes. Prenez un échantillon de 50 ul de la solution eau-Nanoart et le transfert d'un appareil de filtration composé d'un support en polypropylène Swinnex filtre 13 monté avec une membrane de 0,2 um de filtration en polycarbonate (Nuclepore track-etched). L'appareil de filtration est amorcée avec 50 uL 0,2 um filtrées de l'eau distillée avant addition de la suspension de drogue diluée. Le vide est ensuite appliqué à l'appareil jusqu'à ce que le volume de la solution a été entièrement passée complètement tirée de la membrane de filtration. Une fois que la membrane est sèche, elle est apposée sur un talon de tige en aluminium à l'aide du ruban adhésif double carbone bâton de conducteur et de pulvérisation revêtu de palladium. Le stub échantillon est ensuite imagée en utilisant, dans notre cas, un JEOL JSM6300F basse tension, à émission de champ au microscope électronique à balayage (figure 2). 5. Visualisation Nanoart Prenez les suspensions Nanoart préparés et les soniquer pendant 10 secondes à 20% d'amplitude avec une sonde de sonication. Prenez une lame de microscope couvercle de glissement et le placer sur un microscope inversé. Sur la lamelle mélange de 15 ul de la suspension Nanoart avec 100 pi de tampon phosphate salin (PBS) et mélanger par pipetage de haut en bas plusieurs fois. Visualisez les nanoparticules en utilisant un objectif 20x (figure 3). Biologie des Nanoart 6. L'isolement et la préparation du sang Borne macrophages monocytes et les dérivées de monocytes (MDM) Obtenir les monocytes humains par leucaphérèse du VIH-1 et les donateurs séronégatifs hépatite et purifier les cellules par des contre-courant élutriation centrifuge. Evaluer la pureté des cellules par immunomarquage anti-CD68 (clone PK-1) De Wright-tachés cytospins 1. Monocytes purifiés dans la culture DMEM supplémenté avec inactivés par la chaleur de 10% mis en commun le sérum humain, la glutamine à 1%, 50 pg / ml de gentamicine, 10 pg / mL ciprofloxacine et 1000 U / ml facteur humain recombinant colonie macrophages (MCSF) à une concentration de 1×10 6 cellules / ml à 37 ° C dans une atmosphère humidifiée avec 5% de CO 2. Plaque 2×10 6 cellules par puits dans des plaques 6 puits et des cellules en culture pendant 7 jours afin de permettre aux monocytes se différencient en macrophages 1. (Figure 3A) 7. Absorption cellulaire et de Collection Mélanger Nanoart de milieux de culture (sans MCSF) à une concentration finale de 100 uM et ajouter 1 mL de milieu de traitement pour chaque puits. Au point de désirée temps, ou lorsque les cellules sont entièrement chargé avec Nanoart (figure 2), enlever tous les moyens de traitement et de laver les cellules 3 fois avec 1 ml de PBS pour éliminer toutes les particules qui n'ont pas été pris en charge par les cellules. Dans 1 ml de PBS, enlever des cellules adhérentes à partir du bas du puits en utilisant un élévateur de cellules et de les placer dans un tube à centrifuger 1,7 ml 2-4. Centrifuger les cellules à 1000 rcf à 4 ° C pendant 10 minutes. Enlever le surnageant et ajouter 200 ul de méthanol à 100%. Lyse des cellules et de dissoudre Nanoart par une brève (2-5 secondes) sonication du culot avec une sonde de sonication à une amplitude de 20%. Conserver les échantillons au -80 ° C jusqu'au moment d'analyser le contenu de drogue. 8. Rétention intracellulaire des Nanoart Traiter MDM comme décrit en 7.1. Au point de temps souhaité, laver les cellules comme décrit en 7.2, mais au lieu d'immédiatement grattant les cellules, fixer les cellules pendant 15 min à température ambiante dans une solution de glutaraldéhyde à 3% en tampon phosphate 0,1 M (pH 7,4) et encore les fixer à 10 minutes avec le tétroxyde d'osmium à 1% en tampon phosphate 0,1 M (pH 7,4). Retirer fixateur et grattez les cellules dans 1 ml de PBS comme décrit au paragraphe 7.2. En outre, la collecte et de centrifugation des cellules comme décrit en 7.2, mais au lieu d'ajouter du méthanol au culot, ajouter 200 ul de la solution de fixateur glutaraldéhyde. Couper en fines culot cellulaire (80 nm) les articles avec un microtome. Colorez les coupes avec de l'acétate d'uranyle et le citrate de plomb. Observez les coupes colorées en utilisant la microscopie électronique à transmission (figure 4). 9. Communiqué de l'ART Traiter les cellules comme décrit dans 7.1 à 7.2, mais, au lieu de prélever des cellules après le lavage, remplacez PBS avec 2 ml milieu de culture cellulaire sans MCSF et sans Nanoart. Le jour indiqué, ou comme indiqué par milieu de culture cellulaire jaunissent moitié d'échange, de la moyenne. Au jour souhaité, recueillir 1 mL du milieu cellulaire avec des cellules de reproduire tel que décrit dans 7.2 à 7.3. Cellules procédé tel que décrit en 7.3. Moyennes processus en ajoutant 150 pi d'échantillon moyenne à 1 mL de méthanol à 100% et le vortex à pleine vitesse pendant 10 secondes. Puis centrifuger les échantillons à 21000 rcf pendant 10 minutes. Enlever le surnageant et le transférer dans un nouveau tube. Evaporer le méthanol avec une centrifugeuse sous vide, ce qui peut durer de 1 à 4 heures selon l'échantillon. Conserver les échantillons au -80 ° C jusqu'au moment de l'analyse des médicaments. 10. En temps réel L'absorption de Nanoart par microscopie confocale Prenez MDM maturité de l'étape 6.2 et marquer les cellules en utilisant une solution d'étiquetage cellulaires comme solution cellulaire Étiquetage Vybrant suivant les instructions du fabricant. Rincer les cellules 3 fois avec 1 ml de milieu de culture pour enlever tout excès de colorant. Mélanger Nanoart de milieu de culture comme dans l'étape 7.1 en utilisant Nanoart marqués par fluorescence. Ajouter milieu de traitement avec les Nanoart étiquetés immédiatement avant l'imagerie avec un microscope confocal. Capturer une image toutes les 30 secondes pendant 4 heures en utilisant un objectif 60x 5 (Vidéos 1 & 2). Infection VIH-1 et les épreuves d'infectivité 11. VIH-1 ADA infection Traiter les cellules comme décrit dans 9.1 à 9.3. Le jour désiré, enlever tous les moyens et le remplacer par le support, sans MCSF, contenant du VIH-1 ADA à une multiplicité d'infection de 0,01 particules virales / cellule et incuber pendant 24 heures 1. Retirer moyennes virale et remplacer avec des produits frais, sans virus, des médias. Cellules en culture pendant 10 jours échanger la moitié du milieu chaque jour ou au besoin pour garder les cellules vivantes (figure 5) 6. Dix jours après l'infection de recueillir 10 uL de milieu de chaque puits, les placer dans une plaque de 96 puits, et les conserver à -80 ° C jusqu'au moment d'effectuer une analyse de la transcriptase rétroviraux (inverse). 12. Transcriptase inverse (RT) Assay Avec chaque échantillon de 10 uL de l'étape 11.3, mélanger 10 uL d'une solution qui contient 100 mM Tris-HCl (pH 7,9), 300 mM de KCl, 10 mM DTT, 0,1% nonyle phenoxylpolyethoxylethanol-40 (NP-40), et l'eau. Incuber le mélange pendant 15 minutes à 37 ° C 7. <l i> Puis ajouter 25 ul d'une solution qui contient 50 mM de Tris-HCl (pH 7,9), 150 mM de KCl, 5 mM DTT, 15 mM MgCl 2, 0,05% de NP-40, 10 pg / ml de poly (A), 0,250 U / ml d'oligo d (T) 12-18, et 10 pCi / ml de 3H-TTP dans chaque puits et incuber à 37 ° C pendant 18 heures 7. Après incubation, ajouter 50 ul d'glacée d'acide trichloracétique à 10% (TCA) à chaque puits. Récolte des puits sur des filtres en fibre de verre, et d'évaluer les filtres pour 3 H-TTP incorporation par β-scintillation spectroscopie 7. 13. VIH-1p24 Détections Laver les cellules se répliquent à partir de laquelle l'échantillon moyen de la transcriptase rétroviraux a été retirée à l'étape 11.3 par rinçage avec 1 ml de PBS à 3 reprises. Fixer les cellules avec du paraformaldéhyde 4% pendant une nuit à 4 ° C. Le matin suivant, rincer les cellules 3 fois avec PBS. Utilisez anticorps monoclonal de souris contre le VIH-1 p24 (1:10, Dako, Carpinteria, CA) pour visualiser l'infection au VIH. Cellules de l'image sous champ lumineux en utilisant un objectif 40x (figure 6). 14. Les résultats représentatifs: Drogues Taille (Nm) PDI Charge (Mv) Tensioactifs IDV 1052 0,286 -24.58 P188 0,5%, 5,0% SDS, saccharose 9,25% RTV 233 0,273 -7,47 P188 0,5%, 9,25% de saccharose ATZ 840 0,192 25.47 P188 0,5%, 0,1% mPEG 2000-DSPE, DOTAP 1,0%, 9,25% de saccharose EFV 347 0,235 -13.52 1,0% de PVA Tableau 1 Caractéristiques. Physiques de Nanoart Tableau affiche des valeurs représentatives potentiel pour les caractéristiques physiques des formulations Nanoart fabriqués en utilisant des tensioactifs indiqués. Les valeurs comprennent le diamètre moyen basé sur l'intensité de la lumière diffusée, l'indice de polydispersité (PDI, une estimation de la distribution de taille des particules), et les valeurs de potentiel zêta obtenus pour les échantillons nanoformulation diverses. Les abréviations utilisées dans le tableau: IDV: indinavir; RTV: le ritonavir; ATV: atazanavir; EFV: effavirenz; PVA: polyvinylalcool; de sodium dodécyl sulfate SDS; P188: poloxamère 188 (également appelé Pluronic F68); mPEG 2000-DSPE: méthyl-poly (éthylène-glycol) 1,2-distéaroyl-phosphatidyl-éthanolamine; DOTAP: (1-oléoyl-2-[6 – [(7-nitro-2-1 ,3-benzoxadiazol-4-yl) amino] hexanoyl] – 3-triméthylammonium propane. FIGURE 1. Organigramme résumant les diverses méthodes utilisées pour la fabrication de Nanoart. La figure 1 résume les diverses méthodes utilisées pour la fabrication de Nanoart. L'organigramme comprend un temps de surallocation prévue pour chacune des phases critiques des méthodes respectives. FIGURE 2. Images représentant de la morphologie Nanoart désirables et indésirables. Scanning analyse par microscopie électronique (grossissement, 15000 X) de RTV Nanoart produite par homogénéisation, broyage humide, et sonication sur le dessus d'une membrane de 0,2 um de filtration en polycarbonate. Barre de mesure est égale à 2,0 um dans tous les cadres. Nanoart souhaitables consistent, en moyenne, de petites (≤ 2 um) autonome particules à bords lisses qui ont tendance à avoir la même forme ou semblables. Nanoart indésirables varient considérablement en taille et en forme et peuvent fusionner et / ou s'en tenir à un autre. FIGURE 3. Images de solution Nanoart souhaitable et de MDM prenant Nanoart. Lumineux images de microscopie de champ (tous acquis à l'aide d'un objectif 20x) du homogénéisé RTV-NP et MDM prenant Nanoart. Après avoir combiné 10 uL de RTV-NP solution avec 100 ul de PBS sur le sommet d'une lamelle de verre, les particules sont visibles et ressemblent à du sable avec seulement quelques-unes des plus grosses particules étant individuellement identifiables (A). Image de complètement différenciées et MDM forme de fuseau, avant Nanoart traitement (B). Après que les cellules ont repris Nanoart, elles deviennent plus foncées et leurs noyaux deviennent plus apparents en raison de la distribution périnucléaire des Nanoart, mais ils conservent encore leur corps cellulaire en forme de fuseau (C). Une fois que les cellules deviennent surchargés de Nanoart, les noyaux sont obscurcis, et les cellules s'arrondissent, perdant leur structure en forme de fuseau et potentiellement détachant du fond du puits (D). 4 "/> FIGURE 4. Confirmation de l'incorporation cellulaire de Nanoart dans MDM. Microscopie électronique à transmission (grossissement, 15000 x) démontre l'absorption des Nanoart dans MDM exposés à RTV-NP à partir d'homogénéisation (A), RTV-NP à partir de mouture humide (B), RTV-NP à partir sonication (C), et des cellules non traitées (D ). Dans les cellules, les Nanoart devraient être facilement identifiables par leur forme géométrique. Notez l'absence de toute structure géométrique en évidence la cellule de contrôle (D). Un exemple de chaque particule a été décrit: rouge pour l'homogénéisation (A), bleu pour le broyage humide (B), vert pour la sonication (C). La structure des particules devraient ressembler à celle qui a été vu par MEB. Barre de mesure est égale à 5,0 um dans tous les cadres. FIGURE 5. Schéma de la méthode pour tester l'efficacité des antirétroviraux Nanoart. Afin de tester la capacité des Nanoart pour inhiber la réplication virale MDM doit d'abord être traités avec Nanoart puis exposés au VIH-1 de l'ADA. Semblable à la version des études ART, MDM sont chargés avec Nanoart puis lavé pour éliminer toutes les particules qui n'ont pas été intériorisés. Nanoart chargés de MDM sont ensuite cultivées jusqu'à 15 jours avec une moyenne d'échange moitié tous les deux jours. Pendant ce temps (en général les jours 1, 5, 10 et 15) MDM sont mis au défi par le VIH-1 de l'ADA. Après chaque exposition virale des cellules sont cultivées pendant 10 jours afin de permettre à l'infection de progresser. Sur 10 jours post-infection échantillons de supports sont collectées pour analyse par RT et les cellules fixées et colorées pour l'antigène p24. Non-Nanoart MDM traités, infectés et non infectés, sont également cultivées en parallèle et testés pour la présence de l'antigène p24 et de l'activité RT. FIGURE 6. Test d'efficacité Nanoart au VIH-1 MDM infectés par coloration p24. Images en champ clair (20x objectif) de RTV-NP traités MDM 10 jours après avoir été défié par le VIH-1 de l'ADA. Aucune infection n'a été présent lorsque les cellules ont été contestées avec virus1 jours après le traitement Nanoart (A); noter la présence de NP dans le cytoplasme de la plupart des cellules (en médaillon Un indiquées par des flèches). L'infection était présente lorsque les cellules ont été exposées au virus de 10 jours après le traitement Nanoart (B), bien que beaucoup moins que les cellules non traitées avec Nanoart (D); noter la présence maintenue de NP dans certaines cellules (en médaillon B indiquées par des flèches), mais moins au jour 1 de post-traitement Nanoart (Un médaillon). Image de cellules qui ne sont ni traitées, ni avec les Nanoart infectées (C), le manque note de NP au sein du cytoplasme cellulaire (C encadré). Image de cellules qui n'ont pas été traités avec Nanoart mais exposés au VIH-1 ADA (D). VIDEO 1. Direct microscopie confocale de cellules de pauvres RTV-NP absorption par MDM. Microscopie à fluorescence de MDM étiquetés verts avec Vybrant DiO cellule étiquette de la solution et traitée avec du rouge marqué RTV-NP. Une image a été prise toutes les 30 secondes pendant 4 heures à un grossissement de 60x. Cliquez ici pour visionner la vidéo VIDEO 2. Direct microscopie confocale de cellules succès RTV-NP absorption par MDM. Microscopie à fluorescence de MDM étiquetés verts avec Vybrant DiO cellule étiquette de la solution et traitée avec du rouge marqué RTV-NP. Une image a été prise toutes les 30 secondes pendant 4 heures à un grossissement de 60x. Cliquez ici pour visionner la vidéo
