Microtiter 디시 Biofilm 형성 분석
Summary
분석은 박테리아와 곰팡이의 초기 biofilm 형성을 측정하는 빠른 방법을 설명합니다. 이 방법은 미생물의 biofilm 형성에 대한 하층으로 microtiter 접시를 사용하고, biofilm은 크리스탈 바이올렛 스트레인을 사용하여 시각입니다. 분석도 초기 biofilm 형성에 대한 질적 양적 분석 또는를 제공합니다.
Abstract
Biofilms, 의료 산업 및 자연 환경 설정에서 찾을 수 표면에 부착된 미생물의 커뮤니티입니다. 사실, biofilm의 생활은 대부분의 환경에서 미생물의 성장의 predominate 모드를 나타냅니다. 성숙 biofilms 몇 가지 뚜렷한 특징이있다. Biofilm의 미생물은 일반적으로 구조와 지역 사회에 보호 기능을 제공합니다 세포외 기질에 둘러싸여 있습니다. biofilm의 성장 미생물은 일반적으로 유체 – 채워진 채널 둘러싸인 macrocolonies (수천개의 세포를 포함)로 구성된 특성 아키텍처를했습니다. Biofilm – 재배 미생물은 또한 임상 관련 항생제를 포함하여 항균 대리인의 범위에 그들의 저항에 대한 악명 있습니다.
microtiter 접시 분석은 biofilm 형성의 초기 단계의 연구를위한 중요한 도구이며,이 분석은 또한 곰팡이 biofilm 형성을 연구하는 데 사용되었지만, 세균성 biofilms 연구 주로 적용되었습니다. 이 분석은 정적, 배치 성장 조건을 사용하기 때문에, 그것은 일반적으로 흐름 전지 시스템과 관련된 성숙한 biofilms의 형성에 대한 허용하지 않습니다. 그러나, 분석이 잘 세포외 다당류의 생산에 관련된 유전자와 같은 biofilm 형성의 개시 (즉, flagella, 필리, adhesins, 주기적 – DI – GMP 바인딩과 대사에 관여하는 효소)에 필요한 여러 가지 요인을 식별에 효과가있다. 또한 게시된 작품은 microtiter 요리 재배 biofilms은 면역 시스템 effectors 이러한 항생제 내성 및 저항을 성숙 biofilms의 일부 속성을 개발 할 것을 나타냅니다.
이 간단한 microtiter 접시 분석은 벽 및 / 또는 microtiter 접시의 바닥에 biofilm의 형성 수 있습니다. 분석의 높은 처리량 자연은 유전자 화면에 유용합니다뿐만 아니라, 다양한 성장 조건 하에서 여러 변종에 의해 시험 biofilm 형성합니다. 이 분석의 변종은 미생물을 포함한 다양한위한 초기 biofilm 형성을 평가하는 데 사용되지만 pseudomonads, 비브리오 cholerae, 대장균, staphylocci, enterococci, mycobacteria 및 곰팡이, 이에 국한되지 않음되었습니다.
프로토콜 여기에서 설명한에서, 우리는 모델 유기체 녹농균의 biofilm 형성을 연구하기 위해이 분석의 사용에 초점을 맞출 것이다. 이 분석에서, biofilm 형성의 범위는 염료 크리스탈 바이올렛 (CV)를 사용하여 측정됩니다. 그러나, 다른 colorimetric 및 신진 대사 얼룩의 번호는 microtiter 접시 분석을 사용하여 biofilm 형성의 부량에 대한보고되었습니다. microtiter 접시 분석의 용이성, 저렴한 가격과 유연성은 biofilms 연구를위한 중요한 도구가되었다.
Protocol
Discussion
이 방법은 미생물 종의 다양한 사용하기 위해 수정할 수 있습니다. 비 운동성이있는 미생물은 일반적으로 우물의 바닥을 준수하면서 운동성이있는 미생물은 일반적으로, 벽 및 / 또는 우물의 바닥을 준수. biofilm 형성 (즉, 성장 매체, 온도, 부화의 시간)에 대한 최적 조건은 각각의 미생물에 대해 경험적으로 결정되어야합니다. 나는 각각의 접시에 부정적인 컨트롤을 여러 개 수행하는 각각의 변형…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
셰리 Kuchma, 피터 뉴웰과 그림 1의 이미지를 제공 로버트 샨크츠 내 주셔서 감사합니다. 이 작품은 GAO에 NIH 부여 R01AI083256 지원했습니다
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| 1 X M63 | Prepare as a 5X M63 stock by dissolving 15g KH2PO4, 35g K2HPO4 and 10g (NH4)2SO4 in 1 L of water. This stock does not need to be autoclaved and can be stored at room temperature. Dilute 5X stock 1:5, autoclave, cool, then add the desired components. | |||
| KH2PO4 | Fisher | P285-500 | ||
| K2HPO4 | Fisher | P288-500 | ||
| (NH4)2SO4 | Sigma | A5132 | ||
| Magnesium sulfate | Fisher | M63-500 | Add to 1 mM final concentration. Prepare as a 1 M stock in water and autoclave. | |
| Glucose | Fisher | D16-3 | Add to 0.2% final concentration. Prepare as a 20% stock in water and autoclave. | |
| Casamino acids | Beckton-Dickinson | 223050 | Add to 0.5% final concentration. Prepare as a 20% stock in water and autoclave. | |
| Arginine | Sigma | A5131 | Add to 0.4% final concentration. Prepare as a 20% stock in water and filter sterilize. This alternative carbon/energy source can replace glucose and casamino acids | |
| Microtiter plates | Beckton-Dickinson | 353911 | Falcon 3911, Microtest III, Flexible assay plates, 96 well, U-bottom, non-sterile, non-tissue-culture treated. | |
| Microtiter plate lids | Beckton-Dickinson | 353913 | The lids can be reused by cleaning with 95% ethanol in water. | |
| Crystal violet | Sigma | 229641000 | Prepare as a 0.1% solution in water. |
References
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