Microtiter تشكيل بيوفيلم الطبق الفحص
Summary
ويصف وسائل الفحص السريع لقياس وقت مبكر تشكيل بيوفيلم في البكتيريا والفطريات. يستخدم هذا الأسلوب لوحة microtiter كما التحتية لتشكيل بيوفيلم الميكروبية ، وبيوفيلم هو تصور استخدام الكريستال سلالة البنفسجي. في مقايسة يوفر إما فحص نوعي أو كمي لتشكيل بيوفيلم في وقت مبكر.
Abstract
الأغشية الحيوية هي مجتمعات الميكروبات يعلق على الأسطح ، والتي يمكن العثور عليها في المواقع الطبية والصناعية والطبيعية. في الواقع ، الحياة في بيوفيلم ربما يمثل وضع تسود لنمو الميكروبات في معظم البيئات. الأغشية الحيوية الناضجة لها خصائص متميزة قليلة. وتحاط عادة بيوفيلم الميكروبات عن طريق المصفوفة خارج الخلية التي توفر بنية وحماية للمجتمع. الميكروبات تنمو في بيوفيلم أيضا أن يكون سمة العمارة تتألف عموما من macrocolonies (التي تحتوي على آلاف من الخلايا) محاطة مملوءة بسائل القنوات. بيوفيلم نابعة من الميكروبات هي أيضا سيئة السمعة لمقاومتهم لمجموعة من العوامل المضادة للجراثيم بما فيها المضادات الحيوية ذات الصلة سريريا.
في مقايسة طبق microtiter أداة هامة لدراسة المراحل المبكرة في تشكيل بيوفيلم ، وأنها طبقت بشكل أساسي لدراسة الأغشية الحيوية البكتيرية ، وعلى الرغم من أنه تم أيضا استخدام هذا الاختبار لدراسة تشكيل بيوفيلم الفطرية. لأن هذا الاختبار يستخدم ثابت ، دفعة للنمو الشروط ، فإنه لا يسمح لتشكيل الأغشية الحيوية الناضجة التي ترتبط عادة مع أنظمة الخلية التدفق. ومع ذلك ، فقد تم فحص فعالية في تحديد العديد من العوامل اللازمة لبدء تشكيل بيوفيلم (أي ، سياط ، الشعرة ، adhesins ، والإنزيمات المشاركة في دوري – DI – GMP ملزمة والأيض) ، وكذلك الجينات المسؤولة عن إنتاج السكاريد خارج الخلية. علاوة على ذلك ، يشير إلى أن الأعمال المنشورة الأغشية الحيوية التي تزرع في أطباق microtiter القيام تطوير بعض خصائص الأغشية الحيوية الناضجة ، مثل التسامح ومقاومة للمضادات الحيوية المستجيبات الجهاز المناعي.
هذا الطبق microtiter بسيط يسمح للمقايسة تشكيل بيوفيلم على و / أو الجدار السفلي من صحن microtiter. طبيعة إنتاجية عالية للمقايسة يجعله مفيدا للشاشات الجينية ، وكذلك اختبار تشكيل بيوفيلم عن سلالات متعددة في ظل ظروف النمو المختلفة. وقد استخدمت بدائل من هذا الاختبار في وقت مبكر لتقييم بيوفيلم تشكيل لطائفة واسعة من الميكروبات ، بما في ذلك ولكن ليس على سبيل الحصر ، pseudomonads ، الضمة الكوليرية ، كولاي ، staphylocci ، المعوية ، متفطرات والفطريات.
في البروتوكول الموصوفة هنا ، سوف نركز على استخدام هذا الاختبار لدراسة تشكيل بيوفيلم التي الزائفة الزنجارية الحي النموذجي. في هذا الاختبار ، يتم قياس مدى تشكيل بيوفيلم باستخدام صبغة الكريستال البنفسجي (السيرة الذاتية). ومع ذلك ، فقد تم الإبلاغ عن عدد آخر من البقع اللونية والتمثيل الغذائي للالكمي لتشكيل بيوفيلم باستخدام مقايسة لوحة microtiter. حققت سهولة وتكلفة منخفضة ومرونة microtiter مقايسة لوحة أنها أداة حاسمة لدراسة الأغشية الحيوية.
Protocol
Discussion
يمكن تعديل هذه الطريقة للاستخدام مع طائفة واسعة من الأنواع الجرثومية. الميكروبات متحركة تلتزم عادة على الجدران و / أو قيعان الآبار ، بينما غير متحركة الميكروبات تلتزم عادة إلى أسفل الآبار. يجب تحديد الظروف المثلى لتشكيل بيوفيلم (أي نمو متوسطة ، ودرجة الحرارة ، والوقت…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
بي بفضل كوتشما شيري ، وروبرت بيت نيويل السيقان لتقديم الصور في الشكل 1. وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح R01AI083256 لغاو
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| 1 X M63 | Prepare as a 5X M63 stock by dissolving 15g KH2PO4, 35g K2HPO4 and 10g (NH4)2SO4 in 1 L of water. This stock does not need to be autoclaved and can be stored at room temperature. Dilute 5X stock 1:5, autoclave, cool, then add the desired components. | |||
| KH2PO4 | Fisher | P285-500 | ||
| K2HPO4 | Fisher | P288-500 | ||
| (NH4)2SO4 | Sigma | A5132 | ||
| Magnesium sulfate | Fisher | M63-500 | Add to 1 mM final concentration. Prepare as a 1 M stock in water and autoclave. | |
| Glucose | Fisher | D16-3 | Add to 0.2% final concentration. Prepare as a 20% stock in water and autoclave. | |
| Casamino acids | Beckton-Dickinson | 223050 | Add to 0.5% final concentration. Prepare as a 20% stock in water and autoclave. | |
| Arginine | Sigma | A5131 | Add to 0.4% final concentration. Prepare as a 20% stock in water and filter sterilize. This alternative carbon/energy source can replace glucose and casamino acids | |
| Microtiter plates | Beckton-Dickinson | 353911 | Falcon 3911, Microtest III, Flexible assay plates, 96 well, U-bottom, non-sterile, non-tissue-culture treated. | |
| Microtiter plate lids | Beckton-Dickinson | 353913 | The lids can be reused by cleaning with 95% ethanol in water. | |
| Crystal violet | Sigma | 229641000 | Prepare as a 0.1% solution in water. |
References
- O’Toole, G. A., Kolter, R. Initiation of biofilm formation in Pseudomonas fluorescens WCS365 proceeds via multiple, convergent signalling pathways: a genetic analysis. Mol. Microbiol. 28, 449-461 (1998).
- O’Toole, G. A., Doyle, R. J. . Methods in Enzymology. , 91-109 (1999).
- Mah, T. F. A genetic basis for Pseudomonas aeruginosa biofilm antibiotic resistance. Nature. 426, 306-310 (2003).
- Kuchma, S. L., Connolly, J. P., O’Toole, G. A. A three-component regulatory system regulates biofilm maturation and type III secretion in Pseudomonas aeruginosa. J Bacteriol. 187, 1441-1454 (2005).
- Caiazza, N. C., O’Toole, G. A. SadB is required for the transition from reversible to irreversible attachment during biofilm formation by Pseudomonas aeruginosa PA14. J Bacteriol. 186, 4476-4485 (2004).
- Shanks, R. M., Sargent, J. L., Martinez, R. M., Graber, M. L., O’Toole, G. A. Catheter lock solutions influence staphylococcal biofilm formation on abiotic surfaces. Nephrol Dial Transplant. 21, 2247-2255 (2006).
- Caiazza, N. C., Merritt, J. H., Brothers, K. M., O’Toole, G. A. Inverse regulation of biofilm formation and swarming motility by Pseudomonas aeruginosa PA14. J. Bacteriol. 189, 3603-3612 (2007).
- Hinsa, S. M., Espinosa-Urgel, M., Ramos, J. L., O’Toole, G. A. Transition from reversible to irreversible attachment during biofilm formation by Pseudomonas fluorescens WCS365 requires an ABC transporter and a large secreted protein. Mol Microbiol. 49, 905-918 (2003).
- Mack, D. Characterization of transposon mutants of biofilm-producing Staphylococcus epidermidis impaired in the accumulative phase of biofilm production: genetic identification of a hexosamine-containing polysaccharide intracellular adhesin. Infect. Immun. 62, 3244-3253 (1994).
- Vidal, O. Isolation of an Escherichia coli K-12 mutant strain able to form biofilms on inert surfaces: involvement of a new ompR allele that increases curli expression. J. Bacteriol. 180, 2442-2449 (1998).
- Junker, L. M., Clardy, J. High-throughput screens for small-molecule inhibitors of Pseudomonas aeruginosa biofilm development. Antimicrob Agents Chemother. 51, 3582-3590 (2007).
