שיטה לחזות ולכמת F-אקטין מסתיים דוקרני קונוסים הצמיחה העצבית מתוארת. לאחר נוירונים culturing על coverslips זכוכית, תאים permeabilized עם פתרון saponin המכילים. ואז, דגירה קצר עם למאגר saponin המכיל rhodamine-אקטין משלבת אקטין פלואורסצנטי על קצות אקטין חינם תיל.
טיפים ניעתי של אקסונים הגוברת נקראים גביעי צמיחה. קונוסים צמיחה להוביל בניווט אקסונים דרך הרקמות המתפתחות על ידי אינטראקציה עם ביטוי מקומי רמזים הדרכה המולקולרי אשר נקלטות חרוט קולטנים הצמיחה להסדיר את הדינמיקה ארגון של חרוט צמיחה cytoskeleton 3-6. היעד העיקרי של האותות הללו ניווט היא נימה אקטין meshwork הממלא את חרוט צמיחה בפריפריה וכי כוננים חרוט צמיחה תנועתיות באמצעות פילמור אקטין מתמשכת שיפוץ דינמי 7. רמזים הדרכה חיובית או אטרקטיבי לגרום חרוט צמיחה מפנה ידי גירוי אקטין נימה (F-אקטין) פילמור באזור הפריפריה צמיחה חרוט כי הוא קרוב יותר למקור של המקל attractant. זה פילמור אקטין כוננים הצמיחה המקומית חרוט בליטה, הדבקה של השוליים המובילים התארכות axonal כלפי attractant.
פילמור אקטין נימה תלוי בזמינות של מונומר אקטין מספיק על גרעינים פילמור או חוט תיל אקטין מסתיים עבור תוספת של מונומר. מונומר אקטין זמין בשפע הגנגליון ברשתית ואת השורש הגבי חומוס (DRG) קונוסים צמיחה. כתוצאה מכך, גדל במהירות כאשר פילמור חינם F-אקטין מסתיים תיל להיות זמינים בנוסף מונומר. זה מתרחש חומוס DRG קונוסים צמיחה הרשתית באמצעות הפעלת המקומית של ה-F-אקטין אקטין ניתוק חלבון depolymerizing גורם (ADF / cofilin) באזור הגידול חרוט קרוב 8-10 attractant. זו פעילות מוגברת ADF / cofilin מנתקת סיבי אקטין ליצור חדש F-אקטין מסתיים תיל פילמור. השיטה הבאה ממחישה את המנגנון הזה. תוכן הכולל של ה-F-אקטין הוא מדמיין על ידי צביעה עם phalloidin ניאון. F-אקטין מסתיים תיל הם דמיינו על ידי שילוב של אקטין rhodamine בתוך קונוסים צמיחה כי הם permeabilized עם ההליך המתואר להלן, אשר מותאם ממחקרים קודמים של תאים אחרים ניעתי 11, 12. כאשר rhodamine-אקטין נוסף בריכוז מעל ריכוז קריטי בנוסף מונומר אקטין מסתיים תיל, rhodamine-אקטין מרכיבה על קצות התיל חינם. אם קיו אטרקטיבית מוצג שיפוע, כגון ששוחרר micropipette ממוקם בצד אחד של חרוט צמיחה, שילוב של rhodamine-אקטין על ה-F-אקטין קצוות התיל יהיה גדול בצד חרוט הצמיחה כלפי micropipette 10 .
קונוסים הצמיחה הם מבנים תאים קטנים ועדינים. הנהלים של permeabilization קיבעון rhodamine-אקטין, שילוב ויזואליזציה הקרינה הם עשו בקפידה ניתן לבצע על הבמה של מיקרוסקופ הפוכה. שיטות אלה ניתן ליישם לומד פילמור אקטין המקומית נוירונים נודדים, תאים ורקמות אחרות ראשוני או שורות תאים.
השיטות שהוצגו כאן לאפשר ברזולוציה של זמן ומרחב של מרכיבים תאיים המעורבים בשיפוץ הדינמי של cytoskeleton אקטין בשוליים מובילה של נודדות קונוסים צמיחה. הפעולה של מולקולות attractant, כמו NGF או netrin, במהירות כדי לעורר פילמור אקטין נימה מתגלה גידול מקומי מסתיים אקטין תיל, נוצר על ידי …
The authors have nothing to disclose.
המחברים מודים לד"ר ג'יימס Bamburg ואנשי המעבדה שלו לשיתוף פעולה במחקרים אלה. עבודה זו מומנה על ידי מענקים NIH HD19950, EY07133 ועל ידי תרומות של קרן רפואית מינסוטה.
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
18×18 mm coverslip | Gold Seal | 3305 | ||
35mm Petri dishes | Falcon | 351008 | ||
Aquarium cement | DAP 100% silicone aquarium sealant | Any hardware store | ||
Poly-D-lysine (mw > 300,000) | Sigma | P1024 | ||
Natural mouse laminin | Invitrogen | 23017-015 | ||
L1 CAM | R & D systems | 777-NC | ||
Alexa-fluor 350 phalloidin | Invitrogen (Molecular Probes) | A22281 | ||
Rhodamine non-muscle actin | Cytoskeleton, Inc. | APHR-A | ||
F12 Culture medium | Invitrogen (Gibco) | 21700-075 | ||
B27 | Invitrogen (Gibco) | 17504-044 | ||
Slowfade | Invitrogen | 536937 |