Анализ мРНК ядерного Кинетика Экспорт в клетках млекопитающих по Микроинъекция

Есть два микроинъекции основе методов, которые могут быть использованы для измерения кинетики мРНК экспорта в клетках млекопитающих, введение в пробирке синтезированных мРНК, или плазмиды ДНК, которая транскрибируется в естественных условиях в мРНК. Каждый метод имеет свои преимущества и недостатки. Здесь мы опишем оба метода и обсудить различия между двумя подходами. 1. Подготовка материалов для инъекций В пробирке транскрипции мРНК мРНК транскрибируется либо из плазмид или ПЦР продукты, которые содержат ген интереса окружении вверх по течению от соответствующих промоторов РНК-полимеразы (т.е. T7 или SP6 промоутеров). Транскрипция осуществляется в пробирке используя соответствующий фермент (Т7 или SP6 РНК-полимеразы, Invitrogen) с соответствующими нуклеотидами и избыточный аналог шапки. Стенограммы являются полиаденилированной в пробирке использованием поли-A-полимеразы (Invitrogen) и АТФ в соответствии с протоколами производителя. МРНК затем очищают с использованием столбцов либо из Invitrogen или Qiagen. Элюируют мРНК осаждают путем добавления 1/20th объема 3М ацетата калия и 2-х томах 100% этанола при -20 ° C в течение одного часа с последующим центрифугированием при 13000 г при 4 ° С в течение 30 минут. Если избыток жидкости присутствует, гранулы можно мыть ледяной 70% этанола. МРНК в результате осадок сушат на воздухе, то инъекции растворяют в буфере (140 KCl и 10 мм HEPES, рН 7,4). Заметим, что любые загрязнения этанола могут быть токсичными для microinjected клетки. Солюбилизированного мРНК может храниться при температуре -80 ° С в течение длительного хранения. Для микроинъекции, мРНК разбавляют до 200μg/ml в инъекции буфера и смешанных с Орегон Зеленый 488 (ОГ), конъюгированных 70kDa декстрана (1mg/ml; Invitrogen). С ОГ-сопряженных декстрана слишком велик, чтобы диффузного через ядерные поры, он будет позволяют не только определить вводили клетки, но и поможет определить, сколько жидкости вводили в ядре и сколько просочилась в цитоплазме ( см. 4.1.2). Кроме того, любые люминесцентные, высокий молекулярный вес молекулы, которая не может пройти ядерные поры могут быть использованы. Пробы центрифугировали при 13 000 г при температуре 4 ° С в течение по крайней мере 20 минут до начала погрузки иглу, чтобы шарик любые твердые частицы, которые потенциально могут препятствовать кончике иглы. ДНК плазмиды Плазмиды ДНК, содержащей ген интерес может быть подготовлен с использованием стандартных комплектов очистки ДНК из Qiagen. Вообще больше препаратов ДНК, как правило, более высокого качества и, таким образом, более эффективно транскрибируется после инъекции. ДНК плазмиды разбавляют 50 до 200μg/ml в инъекции буфера, содержащего ОГ-сопряженных декстрана 70 кДа (1mg/ml). Перед загрузкой иглы, инъекции жидкости центрифугировали при 13000 г при 4 ° С не менее 20 минут. Иглы для микроинъекции Иглы изготовлены из боросиликатного стекла 1.0 мм капилляров (Item # 1B100F-3, Всемирный точных приборов ООО) с использованием Саттер P97 Flaming / коричневый микропипетки Съемник с 2,5 нити. Инъекции иглами создаются с помощью трехступенчатого тянет программу, используя 2.5×4.5 мм поле нити (пункт # FB245B, Саттер машиностроительный завод). Программа параметров, использованных в этом эксперименте, перечислены ниже, однако они должны быть оптимизированы для каждой нити. Шаг # Тепло Тянуть Скорость Время Давление 1 740 100 8 250 500 2 740 100 8 250 500 3 740 100 10 250 500 (Ramp температура = 740) Сотовые подготовки Вообще любая линия клеток млекопитающих может быть microinjected, однако типы клеток, которые хорошо распространяются, как правило, более склонны к инъекции. Выбор линии клеток может зависеть и от других факторов. Например, РНК, которые кодируют белки выделяются нацелены на поверхности эндоплазматического ретикулума и это гораздо более заметно в COS-7 клеток по сравнению с NIH 3T3 фибробластов 6 (сравнить локализации Т-ЗСТ-Δi мРНК на рисунках 3 и 4). Клетки должны быть посеяны на кислотно-мыть квадратные покровные (25x25mm) в 30 мм petridishes, по крайней мере за 24 часа до микроинъекции. В некоторых клеточных линиях, распространяя можно стимулировать при посеве клеток на покровных фибронектина покрытием 6,8. В идеале сотовой монослоя должна быть примерно 70-90% сливающийся в момент инъекции. Чтобы разрешить для упрощения идентификации вводили клетки, клеточный монослой ранен перед инъекцией с помощью 200 мкл кончиком пипетки пластика. Вообще крест рану (рис. 1), выгравированные на покровное и клетки остаются для восстановления, по крайней мере 15 минут перед инъекцией в культуре ткани инкубатора. Во время микроинъекции, СМИ культуре ткани медленно теряет CO 2 к диффузии, и в результате становится щелочной. Чтобы помочь сохранить нейтральный рН во время инъекции, средств массовой информации может быть дополнен 10 мМ HEPES рН 7,4. Дополнительный буфер может быть добавлен к средствам массовой информации накануне микроинъекции. Микроскоп и микроманипулятора Клетки microinjected использованием инвертированного микроскопа, который изолирован на стол воздух, чтобы минимизировать колебания, которые могут быть разрушительными для микроинъекции процесса. Микроскоп оснащен двумя целями; сухой 10x часть, которая используется для позиционирования элементов и игл, а также сухие 40x дополнительное рабочее расстояние фазы цель, которая используется для изображения микроинъекции процесса. Оптические аберрации за просмотр клеток через покровное и petridish можно исключить, если цель была коррекция воротник. Обеспечение того, чтобы светлое микроскопа правильно выровнен по Келеру освещения 9, также будет способствовать коррекции аберраций вызвано свет, рассеянный инъекционной иглой (см. 2.2.4). Игла управляется с помощью трехосного висит устройство джойстика микроманипуляция (NT-88-V3MSH, Narishige). Грубого манипулятора крепится к задней опорой микроскоп, чтобы игла легко поднимается и опускается в блюдо, сохраняя исходное положение. Игла крепится к палочкой, которая крепится к грубым манипулятором. Трубка соединяет палочки 5cc стеклянный шприц (Item # 512311; Becton Dickinson), который генерирует давление впрыска необходимых для извлечения жидкости из кончика иглы микроинъекции. Для контроля уровня давления, баррель шприц и поршень удерживается на месте шприц регулятором, который состоит из двух пробки, хомут (продается в любом хозяйственном магазине) и двух металлических зажимов (рис. 2). Чтобы убедиться, что шприц поддерживает высокое давление, вакуумной смазки (Dow Corning) применяется к поршень шприца. Флуоресцентного зонда гибридизации Первичной последовательности вводят нуклеиновой кислоты складывается с помощью РНК вторичных программного обеспечения предсказания структуры, такие как RNAstructure 4,6 10. МРНК складки, визуально оценивается как определить области около 50 нуклеотидов, что, как правило, без вторичных структур с высокими температурами плавления, такие как длинные двойные нити. Обратном дополнение к этому региону синтезируется с Alexa546 флуорофора прилагается к 5 'концу зонда (это могут быть приобретены у интегрированные технологии ДНК). Зонд разбавляют водой до концентрации 100 мкм и хранится при температуре -80 ° С в течение 2-3 лет. 2. Внутриядерных Микроинъекция Загрузка инъекция жидкости на микроинъекции микроскопом Примерно 1 мкл инъекции жидкости взята из центрифугировали ДНК или РНК образца с помощьюGELoader советы (Item # 022351656; Epindorff). Жидкость должна быть атмосферный из верхней части образца, чтобы избежать нарушения гранул, которая содержит твердые частицы, которые могут засорить иглы. Кончика пипетки вставляется в задний конец иглы и жидкость выбрасывается. Жидкие будет обращено на кончике иглы под действием капиллярных сил и мениска вблизи острия должны быть видны в течение 5-30сек. Заполненные жидкостью игла вводится в палочку, которая затем крепится к микроманипулятора под углом 45 °. Иглы визуализируется с 10-кратным объективных и расположена в центре просмотр плоскости вблизи фокальной плоскости, используя грубые ручки микроманипулятора. Игла поднял несколько миллиметров, чтобы предотвратить его от повреждения на следующих шагах (2.2.2), а затем столб микроскопом обратно выталкивается обратно. Увеличении давления путем нажатия плунжера 0,5-2CC. Микроинъекция Petridish содержащие покровным стеклом с ранеными монослоя находится на просмотре сцены. Столп микроскопом обратно тянет вперед в вертикальное положение, в результате чего конденсатор быть выровнены и иглы для ввода жидкости. Это должно быть сделано аккуратно, чтобы предотвратить иглы от взлома на покровное (см. 2.1.4). Использование 10x цели центре креста рана определены и игла находится над ячейки, которые будут введены. Увеличение увеличивается за счет перехода на 40x объективных и игла опускается и по центру использовании тонкой ручки регулировки при помощи джойстика. Если изображение не в фокусе, необходимо обеспечить, чтобы падающий свет выровнены (т.е. Kölher освещение 9) с помощью линзы Бертрана (см. 1.5.2). Инъекция должна начинаться на одном углу раны крест и продолжал вдоль одного края для упрощения идентификации вводили клетки при визуализации (см. Рисунок 1). Игла опускается в контакт с ядром. Легко сказать, что клетка была введена на заметное изменение фазы яркость, которая сопровождает инъекции. Если жидкость заполняет всю клетку она может означать, что давление слишком высоки и должны быть снижены. Если никаких изменений в фазу яркость обнаружен, то это может означать, что либо микроинъекции давление не достаточно сильны, чтобы проколоть мембраны клетки, или, что кончик иглы засорен. Это может быть следствием целого ряда вопросов, в том числе: недостаточное давление, несовершенство иглу, и блокирование кончике иглы с небольшим твердых частиц. После загрузки каждого иглу в микроманипулятора требует много времени, и с тех инъекции подложки часто очень ценно, важно, чтобы максимизировать процент иглы, которые могут быть эффективно использованы для инъекций. Ниже шаг за шагом руководство за попытку разблокировать забиты кончике иглы. После каждого шага, следует попытаться придать 2-3cells чтобы оценить, является ли обструкция была удалена: Действие Назначение и цели 1 Отрегулируйте фокус, чтобы посмотреть в длину иглы. Чтобы определить, есть ли очевидное несовершенство иглы или есть ли большой кусок частиц блокирование чаевые. 2 Место иглы рядом плавающий кусок частиц в блюдо. Если жидкость покидает кончика он должен агитировать частиц без вступления в прямой контакт с иглой. 3 Нажмите на поршень до самого конца шприца Это временное повышение давления должно ясно каких-либо препятствий на конце. После выпуска поршень, он должен вырасти сам по себе, а если этого не происходит, это означает, что давление не будучи встроенным в шприц, и вы должны затянуть соединения и / или добавить дополнительные смазки вакууме. 4 Поднимите иглу из клетки медИ. А. Силу рисунок иглу из водной среде может помочь выбить препятствий на кончике иглы. 5 Удалите поршень из шприца полностью и вставить обратно. Это дополнительное повышение давления может потребоваться, чтобы очистить кончике иглы. 6 Царапины иглы на чистую часть покровного Это еще больше возбуждает частицы внутри иглы и позволяет перемещать его для облегчения препятствия на конце. Сильнее царапины могут чип от конца наконечника, что позволяет препятствий для выхода иглы. 7 Нагрузка новую иглу Другой распространенной проблемой является постепенная потеря давления внутри иглы, требующих частого компенсации дальнейшего удручает поршень в шприц. Часто, добавляя дополнительные смазки вакуума поршень шприца может помочь сохранить более последовательной давления. Однако эта проблема может быть связана с утечками связей между шприцем и трубы, трубки и палочки, или палочки и иглы. Большинство утечек воздуха могут быть запечатаны использованием парафильмом (Фишер) или жир, если необходимо, хотя утечки между палочкой и иглой может быть исправлено только путем изменения резиновые прокладки в палочку. Клетки вдоль края раны являются microinjected вдоль края раны в течение фиксированного периода времени (10-15мин). С практикой нескольких сотен клетки могут быть введены в течение этого интервала. После микроинъекции, клетки инкубируют при температуре 37 ° С в культуре ткани инкубатор для желаемого количества времени до фиксации. Если инъекционных ДНК, транскрипция прекращается после 20 минут при обработке клеток с α-аманитин (1μg/ml, Sigma-Aldrich), растворенных в питательной среде. Эта концентрация эффективно подавляет транскрипцию от microinjected плазмиды (рис. 3). Одной иглы могут быть использованы для введения нескольких покровных, хотя и игла должна быть заменена, когда человек меняет тип ДНК или РНК, которая microinjected. Как только игла удаляется из палочки должны быть утилизированы и повторно не используются. Мертвые или плавающие клетки иногда придерживаются иглы и может вмешиваться в микроинъекции. Чтобы удалить этот мусор с иглы, поднять иглу из жидкости отодвигая столб, а затем медленно вставьте иглу обратно в жидкость перенастройки столб в вертикальное положение. Для получения точных измерений ядерных мРНК измерения кинетики экспорт, отдельные образцы должны быть закреплены на 0мин, 15мин, 30мин, 60мин и 120 мин после микроинъекции РНК, или после α-аманитин лечения. 3. Фиксация клеток и окрашивание Фиксация клеток и пермеабилизации В соответствующее время, питательных сред отсасывают и клетки дважды промывали 2 мл PBS раствора (NaCl 137 мм, 2,7 мм KCl, 10 мМ Na 2 HPO 4, 2 мМ KH 2 PO 4, рН 7,4). Важно сохранить покровные влажной за счет минимизации времени они не погружены в жидкость. Клетки фиксируют, добавив 2 мл 4% параформальдегида (Electron наук микроскоп) в PBS в течение по крайней мере 15 мин при комнатной температуре. Фиксированные образцы дважды промывают раствором PBS. Клетки проницаемыми с 2 мл 0,1% Тритон Х-100 в PBS в течение 15 минут при комнатной температуре. Образцы дважды промывают решение PBS. FISH Окрашивание Следующая образцы должны быть подготовлены для гибридизации. Клетки дважды промывали 1х SSC решение (150 мМ NaCl, 15 мм цитрат натрия, рН 7,0) с 25-60% formimide. Для количества формамида, использование той же концентрации, которая присутствует в гибридизации решения (см. 3.2.3). Для подготовки окрашивания камеры, в нижней части 150 мм petridish покрыто водой и кусок парафильмом является плавали на воде. Вода удаляется путем поворота на блюдо, тем самым позволяя парафильмом придерживаться нижней части блюда. Пузырьки воздуха вручную повторноперемещен. Для каждого покровное быть загрязнена, 100 мкл капель гибридизации решение (25-60% формамида, 100мг/мл декстран сульфата, 1mg/ml кишечная палочка тРНК, 5мм ванадила комплекс riboside в 1x SSC с зондом разбавленной 1:500) пипетируются на парафильмом. Обратите внимание, что количество формамида должны быть оптимизированы для конкретного зонда FISH используется. С помощью щипцов, покровное удаляется из 30-мм petridish, то с помощью Whatman фильтровальной бумаги (VWR) обратной стороне (бесклеточной) стороне покровного стекла высушивают и избыточный буфер злых из передней части без сушки фиксированной клеток. Покровное помещается лицевой стороной вниз на FISH решение. Это повторяется для каждого покровное. После размещения крышки камеры окрашивания обратно, образцы выдерживают в течение 5-18hrs при температуре 37 ° C. Промывка и монтаж витражей Образцы Несколько камер стиральной выполнены в том же порядке, окрашивание камере (см. 3.2.2). Для каждого покровное, 1 мл промывочного буфера (1x ГТК с 25-60% формамида) является пипеткой на парафильмом из моечной камеры. Опять же, использование той же концентрации формамида, который присутствует в гибридизации решения (см. 3.2.3). Чтобы удалить из покровных окрашивания камера, 1 мл промывочного буфера пипеткой рядом с покровным. Жидкость должна быть обращено под каждого образца под действием капиллярных сил. Использование щипцов, покровные удаляются, и каждый из них помещается капля моющего буфера и инкубируют при комнатной температуре в течение 5 мин. Шаги 3.3.2 на 3.3.4 повторяют еще два раза, так что каждый покровное промывается в общей сложности 3 раза. Если РНК должна быть costained с некоторыми белка иммунофлюоресценции, см. раздел 3.4. Слайды промывали 70% этанолом и сушат Kimwipes. Для каждого покровное, 10-30 мкл решение для монтажа с DAPI (Fluoromount G, Южной Biotech) является пипеткой на слайдах. Каждый слайд может разместиться два покровные. Использование щипцов и Whatman фильтровальной бумаги, задней покровные сушат и избыток жидкости нечестивых от лицевой стороне покровного стекла без сушки образцов. Каждый покровное помещается лицевой стороной вниз, на каплю решение для монтажа. Конная образцы можно хранить при 4 ° C. Иммунофлуоресцентного метода Образцы должны быть дважды промывали PBS, чтобы удалить формамида, которые могут помешать надлежащей меченых антител. Для каждого покровное, 50 мкл первичных решение антител (1.0μg/ml антител, 0,1% TX-100, 0.1mg/ml РНКазы без BSA в PBS) является пипеткой на парафильмом из моечной камеры. Использование щипцов, покровные размещаются ячейки стороной вниз на первичном решение антител и инкубировали при комнатной температуре в течение 30 минут. Для каждого покровное, два 1мл капель PBS пипетируются на парафильмом из моечной камеры. Чтобы удалить из покровных решение меченых антител, 1 мл PBS является пипеткой рядом с покровным. Жидкость должна быть обращено под каждого образца под действием капиллярных сил. Использование щипцов, покровные удаляются, и каждый из них помещается на первой капли PBS за 5 минут, а затем помещается на вторую каплю PBS в течение еще 5 мин. Шаги 3.4.2 на 3.4.6 повторяются использованием флуоресцентных антител вторичного решение (1.0μg/ml антител, 0,1% TX-100, 0.1mg/ml BSA в PBS). Заметим, что поскольку маркер впрыска и РНК, которые видны в зеленый и красный канал, вторичные антитела должны быть сопряженными к совместимому красителя, таких как Alexa647. Покровные стекла монтируются как в 3.3.7. 4. Изображений и количественной Изображений Epifluorescence микроскоп используется для изображения клеток после инъекции. Введенный клетки могут быть расположены за счет размещения крест раны и выявления клеток с вводят маркер (ОГ-декстран). Для каждой ячейки наблюдается картина вводят ОГ-декстран приобретается. При визуализации microinjected мРНК важно, что количественная ограничивается клетки, которые получили> 90% от вводимой жидкости (например, декстран) в ядре. Образ РНК затем приобрел. Для обеспечения точного измерения РНК, время экспозиции между всеми клетками в течение определенного срока конечно, должны оставаться неизменными и находятся в пределах динамического диапазона камеры. В идеале каждое изображение должно включать uninjected ячейки, чтобы иметь возможность надлежащего расчета фоновой флуоресценции инnsity (см. 4.2.4). Для помощи в количественном, образ DAPI пятна также могут быть приобретены. Также, если иммунофлюоресценции была выполнена, окрашенных белков также может быть образ. Например мРНК распределения в различные моменты времени курс показано на рисунке 4. МРНК кодирует секретируемый белок и, таким образом, ориентированы на ER в COS-7 клетках. Обратите внимание, что ER-таргетинга была проверена совместно окрашивания РНК с антителами против TRAPα, житель белка ЭР 11. Квантификация Это может быть достигнуто с рядом различных пакетов программного обеспечения для анализа изображений. ImageJ программное обеспечение хорошо подходит для количественного распределения сотовой мРНК, поскольку она может быть использована, чтобы вручную отдельных ядерных и цитоплазматических фракциях, он может измерять среднюю флуоресценции этих фракций, и ее выходные данные можно легко копировать и вставлять в другое программное обеспечение, например, Microsoft Excel. Изображения соответствующие FISH, ОГ-декстран, и DAPI флуоресценции открыты и объединены использованием изображений в стеке инструмент. В любом DAPI или декстран слой Порог инструмент используется для изоляции области, соответствующей microinjected ядра. Эта часть выбирается с помощью жезла инструмент, а после переезда в FISH слой, область (КНУ) и среднее / средней интенсивности (F КНУ) записываются с использованием Мера инструмент. Клетка периметр, изложенные с помощью инструмента Freehand отбора, и в то время на FISH слой района (Тот) и средняя / средней интенсивности (F Тотом) записываются с использованием Мера инструмент. Если флуоресценции мобильный является значительно более интенсивным, чем в фоновом режиме, вы можете использовать инструмент порога, а не инструмент Freehand выбор определяйте ваши нужную ячейку. Использование прямоугольных функцию, которая выбирает поле обращается за uninjected клеток и среднее / средней интенсивности (F Назад) записывается. Все измерения будут скопированы на лист Excel. Экспортируемые мРНК рассчитывается по следующей формуле: Nuc Площадь ядра Тот Площадь всей клетки F Nuc Средняя флуоресценции ядерной фракции F Тотом Средняя флуоресценции целом фракции клеток F Назад Средняя флуоресценции untransfected ячейки Для каждого момента времени средних экспортных% рассчитывается и построены с течением времени. Стабильность мРНК рассчитывается путем построения средняя общая флуоресценции мРНК (Тотом х (F Тот – F Назад)) с течением времени. Обычно мы находим, что количество мРНК значительно варьируется между клетками и между покровные. Это может быть из-за несоответствия между темпами иглой потоком и между эффективностью FISH окрашивания. Рисунок 1. Микроинъекция покровное. Клетки выращиваются, пока они не 70-90%, то сливающийся раненых по вертикали и горизонтали использовании 200 мкл кончиком пипетки пластика. Начиная с кросс-рана, клетки вводятся по одному края раны (стрелка). Рисунок 2. Шприц регулятора. А) Схема демонстрации того, как шприц регулятор собирается. B) Схема собрана аппарата. С) фотографии собрал шприц регулятора. Рисунок 3. Воздействие α-аманитин на транскрипцию ДНК плазмиды вводили. NIH3T3 фибробластов клеток, которые были предварительно обработаны с различной концентрациейх α-аманитин, вводили Т-ЗСТ-Δi плазмидной ДНК и ОГ-сопряженных 70kD декстран. Введенный клетки инкубировали при 37 ° С в течение 1 часа, а затем фиксировали и окрашивали для Т-ЗСТ-Δi мРНК с использованием конкретных FISH probe6. Каждая строка соответствует одно поле зрения отображаемого для OG-70kDa декстрана и т-ЗСТ-Δi мРНК. Обратите внимание, что высокая, но не низкие, концентрации препарата полностью подавляется продукция Т-ЗСТ-Δi стенограммы. Шкала бар = 15 мкм. Рисунок 4. Время хода мРНК ядерного экспорта. COS-7 клетки вводили Т-ЗСТ-Δi плазмидной ДНК и ОГ-сопряженных 70kD декстран. 30мин следующие клетки инъекции лечили α-аманитин и инкубировали при 37 ° С в течение указанного момента времени. Затем клетки фиксировали и окрашивали зонд против Т-ЗСТ-Δi мРНК и с антителами против маркеров ER TRAPα. Каждая строка соответствует одному полю клеток. А) мРНК распределение следующее микроинъекции timecourse. Б) раздутия 120 мин момент времени из () демонстрация совместной локализации Т-ЗСТ-Δi мРНК и ER. Наложение Т-ЗСТ-Δi мРНК (зеленый) и TRAPα (красный) окрашивания показана на правой панели. Шкала баров = 15 мкм.