環境的に誘導されたフラックスの変化を遺伝

1。誘導条件下での亜麻の成長。 5"ポットは、土壌を充填し、確定されています。 ポットごとに3つの種子が植えられている¼インチ深いと土は、種子を介して確認した。 ポットは、適切な栄養溶液100mlのと水遣りされています非誘導コントロール（C）の条件は、毎週1 / 10の強度ミラクル-グロを使用してください。高栄養状態（NPKの治療は）完全な強度のミラクルは毎週適用育てていた。低栄養 – 植物は彼らの成長全体に適用される水道水を持っていた。 （デュラン1971、カリス1980）。 植物は夏の間、自然光の下で栽培されています。冬の間、彼らは8分の16時間の明/暗サイクルでナトリウム灯の下で栽培されています。 週間間隔で葉や分裂組織が収集されます。 植物材料は、迅速に液体窒素中で凍結されています。 結果 3つの遺伝子型は、条件（図1）に応じて異なる相対的な速度で成長する。したがって、制御条件の下でのPLラインは、LはS（図1a）よりも活発であることで最高の成長。低栄養素（水）の下で、SはLまたはPL（図1b）のいずれかより良い成長。高栄養下で（NPK）、LはSよりわずかに良い成長（図1c）PLよりも優れて成長する。 F. – 3つの異なった治療法で育成した行のそれぞれの間の比較を図1のDに示されていますPLは高い栄養と制御条件（図1F）の両方で同様に高栄養（図1e）とSで最高の、Lを制御条件下で最高の成長（図1d）。 これらのデータは3行が3つの環境下での彼らの成長に基づいて区別できることを示している。注目すべきは、LはNPKの条件（それが誘導されたの下）の下で最高の成長ながら、PLは制御条件の下で最高の成長ということです。 Sが3つの条件すべてに同じ程度成長する、つまり、それは改善された栄養条件を活用することではありませんが、良い、非常に低栄養条件下で成長することが可能です。 植物の分化に関連する成長パラメータは、植物の高さ（とそれぞれの葉の間の距離ですこの節間長、関連付けられている）、葉の大きさや分岐の程度が含まれています。 plに関する制御条件の下で植物は枝と背が高いと葉が大きく、濃い緑色です。低栄養素の下で植物が非常に短い場合、各葉の間の距離も非常に短く、葉が小さく、薄い緑色です。先端の葉が茎ダウン低いものよりも暗い緑です。高い栄養素の下で植物は主茎や側枝の両方がコントロール植物に比べて短いことを除いて、制御条件の下でそれと非常によく似ています。大genotrophのための植物は高い栄養素の下で最も活発な成長点を除いてPLのものと非常によく似ています。再び低栄養素で植物は非常に短く、光の緑の葉を持っています。葉は低い栄養素の下に軽く緑色ですがS genotrophは、3種類の環境すべてで同じように成長する。しかし、低栄養状態でS genotrophはPLまたはLラインのどちらよりもはるかに活発です。 2。亜麻の分裂と葉からRNAとDNAの抽出を別々に行われます。ロシュトータルRNAプレップキットはRNA抽出のために使用され、キアゲンDNeasy植物DNAプレップキットは、DNA抽出に使用されていました。 RNA抽出 3分裂組織およびいくつかの周囲の葉は、エッペンドルフチュー​​ブにストレージクライオバイアルから移動し、地面になる準備ができるまで、液体窒素中に配置されます。 滅菌砂をチューブに添加され、組織は罰金までmicropestleを使用して粉砕される。 ロシュトータルRNAプレップキットから400 ulの溶解/結合バッファーを添加していない塊が表示されていないまで、組織はさらにグランドです。 サンプルは、砂やごみを収集するために13,000 rpmで1分間スピンして溶解を助けるとに15のために秒をボルテックスしています。 上清をカラムにスピンに追加され、指示されたとおりにRNAプレップキットの説明書の残りの部分が続いている。 DNase処理 10XのDNaseバッファーの1 / 10のRNAサンプルの量が追加されます。 DNaseの30単位を添加し、反応を37℃でインキュベートされた℃で30分間、70℃で5分間のためのC。 逆転写 cDNAをキットにアプライドバイオシステムズRNAが当たり方向、37度でインキュベート反応℃で1時間および95℃で5分間として使用されます。 cDNAは、PCRや定量PCRに使用されます定量PCR 定量PCRはABIのステップOneシステムを用いて行った。すべてのアッセイは、実行ごとに三連で行った。アクチン遺伝子はコピー数の制御などに使用された利用可能な最善のハウスキーピング遺伝子。 適切なプライマー対は、1μlの各チューブに添加した。 cDNAは、適切な濃度と9μlに希釈し、各チューブに添加 2倍のパワーSYBRグリーンPCRマスター（ABI）の10μlを、各管に添加したプログラムの増幅プログラムがあった。 95℃で10分° C 95℃15秒の40サイクル° C、60 ° Cで1​​分増幅の特異性を確認するために熱変性のステップ相対的な発現レベルは2の値（ – CTactin CTunknown）により決定した。 DNA調製キアゲン社DNeasy植物DNAプレップキットからバッファAP1は、マイクロ遠心チューブに滅菌砂で6葉に追加されます。ない塊が表示されていないまで、組織はmicropestleで粉砕される。 キットの指示は、指示どおりに続いている。 結果幹に沿って様々な位置での葉から単離したDNAからのPCR増幅は植物が誘導条件（4）の下で成長している間にLIS – 1の外観が発生したことを示しています。定量PCRの結果は、LIS – 1（または誘導に関連する他のゲノムの変化）の存在が、LIS – 1のすぐ近く（図2）の遺伝子の発現に影響を​​及ぼすことを示している。図2に示す6つの遺伝子は、すべての差動4つ以上のPLの発現（LIS – 1を適用していない）とSのより高い発現を（LIS – 1を持っていない）有する二つを持って使用して、PLとSで表されます。パネル1と2は、LIS – 1の挿入ポイントに近い位置にある2つの遺伝子である。大genotrophでこれらの遺伝子の発現（これは誘導される変化があったがLIS – 1を持っていない）とは異なる成長条件での発現は、LIS – 1と発現の変化との間に因果関係を判断するために必要となる。 図1。PL、LとSは、3種類の栄養素体制の下で成長した。パネル – コントロール、B – 低栄養素およびc – NPK。 D – PL、E – S、F – D L.パネル – fを左から右へ：低栄養素、コントロールとNPK。 D – PL、電子 – L、F – S. LIS – 1の挿入ポイントの周りの図2。遺伝子発現。遺伝子1（成長の阻害剤）LIS1にすぐに5'であり、LIS – 1の遺伝子2（キップ関連のサイクリン依存性キナーゼ阻害剤のID 3"。他の遺伝子はすべてから構築された同一の足場（〜500KB）に沿っている亜麻のゲノム配列を完了してください。下さい大きな図をご覧いただくにはこちらをクリック 。 図3。低栄養条件下で栽培ストーモントシーラスの植物の個々の葉から抽出したDNAのPCR増幅。 PCR産物を2％アガロース- TBEゲル上で分離した。 uninsertedサイトがパネルに示されている、挿入部位の両端は、パネルBおよびCに示されています葉のサンプル1から6は、サンプル1は、播種後早いいると毎週の間隔で分離した。