1. Verwijdering van de buik borstklier en de opstelling van een hele berg Euthanaseren het dier volgens de IACUC richtlijnen. Pin het dier op zijn rug van zijn benen met naalden, of tape de benen op het oppervlak raad van bestuur, en veeg de huid nat met ethanol (EtOH). Til de huid een beetje met een pincet en met scherpe schaar een middellijn incisie in de huid te beginnen tussen de twee # 5 tepels en snijden in de richting van de nek. Maak een omgekeerde Y incisie vanaf de middenlijn richting de achterpoten. Als thoracale borstklieren zijn ook worden verzameld, maken ook een Y incisie vanaf de middellijn tussen de twee # 2 tepels naar de voorpoten. Ontleden van de huid met een schaar open aan een kant van de omgekeerde Y-incisie aan de buik # 4 borstklier bloot te leggen; de borstklieren zijn bevestigd aan de huid. Pin van de huid met naalden op het oppervlak bord, volledig bloot te leggen van de klier. Werk de ene kant en klier in die tijd. Ontleden de melkklier, zonder uit de huid hetzij met behulp van scherpe schaar en / of een scalpel, vanaf het proximale gebied dicht bij de tepel en werken aan het distale einde van de klier naar de rug van het dier. (Dit kan enkele minuten duren, vooral bij een oudere rat.) Onmiddellijk spreiden van de vrijstaande klier op een juiste wijze gelabeld glaasje (gebruik een goede permanent marker pen en / of 'een diamant pen'), en verspreid de klier goed overeenkomt met de oorspronkelijke grootte en vorm in situ. De glasplaatje moet groter zijn dan de klier. Na het verspreiden van de klier op de glijbaan, laat het op de tafel gaan zitten voor een tijdje, zodat de klier stokken op de glijbaan, maar laat het niet droog. Zet de schuif in een pot met daarin Carnoy's fixatief (75% ijsazijn, 25% absolute ethanol = EtOH), laat het je vast bij kamertemperatuur (RT) in de zuurkast voor 2 dagen of langer. Dia's kunnen ook worden achtergelaten in de fixeermiddel voor een langere periode van tijd. Was de dia's in 70% EtOH gedurende 1 uur bij RT. Spoelen in gedestilleerd water gedurende 30 minuten bij RT. Vlek in Carmine Alum vlek *) voor 2 dagen of langer (tot je ziet dat de lymfeklieren hebben bevlekt door, kijk naar de achterkant van de dia). Wassen in toenemende reeks van EtOH, 1 uur in elke: 70% -> 95% -> 100%. Na de laatste wasbeurt in absolute EtOH de klieren zetten in xyleen. Laat zitten in de zuurkast in RT althans voor twee dagen. Deze laatste stap is het ruimen van de melkklier betekenis delipidation van het uiervet pad, en de latere toename van de transparantie. Hoe vetter de klier is de langere clearing tijd nodig is. Mount with cover-slips met behulp van een montage van media zoals Permount. Nou laten we de dia's drogen (enkele dagen) alvorens op te merken onder een stereo-microscoop. * Carmine Alum Stain: Plaats een g karmijn (Sigma C1022) en 2,5 g aluminium kaliumsulfaat (Sigma A7167) in 500 ml gedestilleerd water en kook ze gedurende 20 minuten. Pas uiteindelijk volume van 500 ml met water. Filter en koelkast. Oplossing kan worden gebruikt voor enkele maanden. Gooi als kleur wordt zwak. 2. Analyse van de borstklier Hele Mount Morfologie Borstklier hele mounts morfologie wordt geanalyseerd op basis van de volgende eindpunten en de resultaten gecorreleerd met borstkanker risico. Borstklier whole-mount at PND 21 (pre-puberale leeftijd): Epitheliale groei: Afstand van de tepel tot aan het einde van de epitheliale boom (in millimeters), gemeten met behulp van een liniaal Potentieel voor maligne transformatie: Aantal TEBs (uiteinde knoppen), geteld onder een lichtmicroscoop. TEBs zijn de grootste bolvormige structuren zich pas aan het distale uiteinde van de borstklieren epitheliale boom Differentiatie: AB1 (alveolaire knop) score (0-5). Alveolaire knoppen zijn verspreid over het epitheel. AB2 score (0-5) Gehelen mounts worden gescoord onder een lichtmicroscoop. De score waarden van AB1 en AB2 worden toegevoegd voor een laatste differentiatie score. Borstklier hele-mount verzameld op PND 50 (post-puberale leeftijd): Epitheliale groei: Afstand van de lymfeklieren aan het einde van de epitheliale boom (in millimeters), gemeten met behulp van een liniaal. Afstand tussen het uiteinde van de epitheliale boom aan het einde van vet pad, gemeten met behulp van een liniaal. Potentieel voor maligne transformatie: Aantal TEBs, geteld onder een lichtmicroscoop Differentiatie: AB1 score (0-5) AB2 score (0-5) Melkklieren score (0-5) Gehelen mounts worden gescoord onder een lichtmicroscoop. Differentiatie zal worden beoordeelt op twee manieren. Eerst worden de score waarden van AB1, AB2 en lobules toegevoegd voor een laatste differentiatie score. Daarnaast zal de verhouding tussen de melkklieren score en AB1 + AB2 score worden berekend. AB differentiëren naar melkklieren, en hoe hoger de verhouding tussen de melkklieren en ABS, het meer gedifferentieerde de klier is. 3. Palpatie en mammatumor Meting in ratten en correlatie met borstklier Morfologie Om te beginnen deze procedure, houdt de rat door vast te pakken het hele lichaam met de handpalm over de rug, met wijsvinger achter het hoofd en de duim en de tweede vinger onder het tegenovergestelde oksel. Draai de rat dus het ligt op zijn achterste, en palperen om eventuele borsttumoren op te sporen; voelbare tumoren moeten voelen als een "klomp". Naast gebruik van een schuifmaat om de breedte, lengte en hoogte van de tumor te meten. Bereken de tumor volume met behulp van de ellipsoïde formule, Volume = 1/6πabc, waar 'een' = breedte 'b' = lengte, en 'c' = hoogte. Handmatig registreren van de locatie en de grootte van de tumor in een notebook op een wekelijkse basis. Deze gegevens zullen worden overgedragen aan een spreadsheet later. 4. Representatieve resultaten Zorgvuldige dissectie van het uiervet pad en de verwerking ervan tot wholemount zal beoordeling van de ontwikkeling staat van de borstklier. Wanneer elke stap goed is gedaan, de hele borstklier epitheliale boom is duidelijk zichtbaar in het vet pad, en dit maakt een eenvoudige vaststelling van het aantal TEBs en de berekening van de dichtheid van de alveolaire knoppen en melkklieren. Misstappen bij de voorbereiding van wholemounts kan niet de hele dikke pad, onvoldoende tot vaststelling, en inadequate clearing ontleden. Beoordeling van de borstklier morfologie zal informatie over het aantal structuren aanwezig zijn die aanleiding kunnen geven tot mammatumoren (TEBs), mate van differentiatie van de epitheliale structuren (alveolaire knoppen en melkklieren), en de mate van groei (ductaal verlenging). Het is belangrijk om TEBs scheiden om uiteinden, de laatste bevinden zich aan het distale uiteinde van het epitheel, vergelijkbaar met TEBs, maar ze zijn kleiner dan TEBs en geen aanleiding geven tot kwaadaardige tumoren. Uiteinden worden ook gezien in de epitheliale boom. Figuur 1:. Vertegenwoordiger resultaat van goed voorbereid borstklier hele berg Alle onderdelen van de klier goed zijn ontleed en karmijn kleuring is optimaal. Figuur 2:. Vertegenwoordiger gevolg van een slecht voorbereid borstklier ganse berg De klier goed is ontleed (het distale gedeelte van de klier ontbreekt), is niet behoorlijk uitgerekt en delipidation heeft niet volledig plaatsgevonden.