في التصوير من يرقات ذبابة الفاكهة فيفو سليمة الفرعية الخلوية في القرار
Summary
هذا البروتوكول توضح طريقة موثوقة لالتخدير والتصوير من دون تغيير<em> ذبابة الفاكهة السوداء البطن</em> اليرقات. وقد استخدمت نحن مخدر desflurane المتقلبة للسماح للتصوير المتكررة على المستوى شبه الخلوية القرار ، وإعادة تحديد الهوية هياكل لمدة تصل إلى بضعة أيام<sup> 1</sup>.
Abstract
وقد مكنت التحسينات التي حدثت مؤخرا في مجال التصوير الضوئي ، fluorophores المرمزة وراثيا والأدوات الوراثية السماح بإنشاء كفاءة الحيوانات المعدلة وراثيا خطوط المطلوب أن يكون درس العمليات البيولوجية في سياق لقمة العيش ، ويتصرف في بعض الحالات بل والحي. في هذا البروتوكول سنقوم بشرح كيفية تخدير يرقات ذبابة الفاكهة سليمة ، وذلك باستخدام مخدر desflurane متقلبة ، لمتابعة تطوير واللدونة متشابك من السكان في القرار 03/01 شبه الخلوية. بينما الأساليب الأخرى المفيدة لتخدير يرقات ذبابة الفاكهة السوداء البطن وقد وصفت سابقا 4،5،6،7،8 ، البروتوكول المقدمة في هذه الوثيقة يوضح تحسينات كبيرة بسبب الميزات الرئيسية التالية مجتمعة : (1) وجود درجة عالية جدا من التخدير ، وحتى تم القبض ضربات القلب مما يسمح القرار الوحشي تصل إلى 150 نانومتر 1 ، (2) معدل البقاء على قيد الحياة مرتفعة من 90 ٪> التخدير لكل دورة ، والسماح في تسجيل أكثر من خمس نقاط لمرة وعلى مدى فترة من ساعات إلى أيام 2 و ( 3) حساسية عالية تمكننا 2 في الحالات لدراسة ديناميات بروتينات التي أعرب عنها في المستويات الفسيولوجية. في التفاصيل ، كنا قادرين على تصور مستقبل الغلوتامات بعد المشبكي الوحيدات GluR – IIA أعرب عبر المروج الذاتية 1 في خطوط المعدلة وراثيا ومستقرة خط فخ اكسون FasII GFP – 1. (4) وخلافا لأساليب أخرى يمكن تصوير 4،7 اليرقات ليس فقط على قيد الحياة ، ولكن أيضا سليمة (أي غير تشريح) السماح الملاحظة أن تحدث على مدى عدة أيام 1. تفاصيل الفيديو المرافقة وظيفة الأجزاء الفردية من الجسم الحي في غرفة التصوير 2،3 ، والصحيح المتصاعدة من اليرقات ، وإجراء التخدير ، وكيفية إعادة تحديد مواقف معينة داخل يرقة وإزالة آمنة من اليرقات من التصوير الغرفة.
Protocol
Discussion
وقد وضعت في البداية قدم طريقة لدراسة نقاط الاشتباك العصبي glutamatergic على عضلات جدار الجسم يرقات ذبابة الفاكهة melanogaster. تتميز ذبابة الفاكهة تقاطع العصبية والعضلية (NMJ) من قبل المعمارية خلوي النمطية للعضلات والاعصاب وبالتالي فهي مناسبة بشكل مثالي للتصوير في الجسم الحي. ومع ذلك ، لا يقتصر على وصف لبروتوكول التخدير التصوير NMJ ؛ شفافية يرقات ذبابة الفاكهة يسهل التكيف التابع لبروتوكول وصف لدراسة تطوير الأجهزة ، والهجرة من الخلايا ، ونقل البضائع وإعادة التنظيم المحاور الفرعية الخلوية داخل الخلايا.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر Schönle اندرياس ، ماكس بلانك ، ، معهد الكيمياء والفيزياء الحيوية وألمانيا وديفيد ساندستروم J. ، المعهد الوطني للصحة العقلية ، المعاهد الوطنية للصحة في بيثيسدا ، MD ، الولايات المتحدة الأمريكية للحصول على المشورة التقنية. نشكر فرانك Kötting ، المعهد الأوروبي لعلم الأعصاب ، غوتينغن لبناء غرفة التصوير وجهاز تخدير. وأيد هذا العمل من المنح المقدمة من مبادرة الإضافية اطلعوا على الزهايمر TMRYZ أيده زمالة من مجلس المنح الدراسية الصينية ، SBH بواسطة الزمالة من كلية الدراسات العليا للعلوم الأعصاب الخلوية والجزيئية في جامعة توبنغن.
Materials
Reagents:
- Desflurane (Suprane, Baxter, Unterschleißheim, Germany)
- Halocarbon oil (e.g. Voltalef H10S oil / Atofina, Puteaux, France)
- Fly culture medium
Equipment:
- Inverted confocal microscope
- Binocular microscope (e.g. Stemi 2000, Carl Zeiss, Jena, Germany)
- Small paintbrush as used to sort flies
- Incubator
- Custom built imaging chamber (For mechanical drawings see Ref. 3)
- Vaporizer/anesthetization device (For details see Ref. 3)
References
- Rasse, T. M. Glutamate receptor dynamics organizing synapse formation in vivo. Nat Neurosci. 8, 898-905 (2005).
- Rasse, T. M. . In vivo imaging of long-term changes in the Drosophila neuromuscular system [dissertation]. , (1988).
- Fuger, P., Behrends, L. B., Mertel, S., Sigrist, S. J., Rasse, T. M. Live imaging of synapse development and measuring protein dynamics using two-color fluorescence recovery after photo-bleaching at Drosophila synapses. Nat Protoc. 2, 3285-3298 (2007).
- Wang, X., Schwarz, T. L. Imaging axonal transport of mitochondria. Methods in enzymology. 457, 319-333 (2009).
- Vinegoni, C. Mesoscopic fluorescence tomography for in-vivo imaging of developing Drosophila. J Vis Exp. , (2009).
- Lin, C. Y. Label-free imaging of Drosophila larva by multiphoton autofluorescence and second harmonic generation microscopy. Journal of biomedical optics. 13, 050502-050502 (2008).
- Levitan, E. S., Lanni, F., Shakiryanova, D. In vivo imaging of vesicle motion and release at the Drosophila neuromuscular junction. Nat Protoc. 2, 1117-1125 (2007).
- Zito, K., Parnas, D., Fetter, R. D., Isacoff, E. Y. &. a. m. p. ;. a. m. p., Goodman, C. S. Watching a synapse grow: noninvasive confocal imaging of synaptic growth in Drosophila. Neuron. 22, 719-729 (1999).
