我们描述а纯,高度耦合的大鼠心脏细胞生物能,生物物理测量学,蛋白质组学或线粒体DNA和脂质分析的功能或结构的研究线粒体隔离协议。
在氧化磷酸化的的过程中在细胞内ATP生成的线粒体的功能,是举世公认的。在过去几十年中已经出现了重大进展,我们比其他能源发电的线粒体的功能的认识。这些措施包括在细胞凋亡中的作用,作为信号的细胞器,哺乳动物发育和老化细胞的新陈代谢和细胞增殖之间的协调所作出的贡献以及的。我们的生物过程由线粒体调制的理解是基于强劲隔离和处理实验动物组织的完整线粒体方法。从大鼠心脏线粒体是细胞代谢的过去和目前的研究,包括对敲除动物的研究中最常见的准备工作之一。
在这里,我们描述了一个详细的隔离与耦合的高度完整的线粒体快速的方法。大鼠心脏线粒体的这些准备工作是出色的功能和结构研究,对细胞的生物能,生物分子,蛋白质组研究和分析线粒体DNA,蛋白质和脂质的运输对象。
迅速隔离与耦合的高度完整的线粒体协议详细描述。准备获得可用于功能或结构,对细胞的生物能学,蛋白质组学研究或线粒体DNA的分析和脂肪含量的研究。也可以进行主动运输的离子和代谢中间体的生物物理研究。这是可能的进一步过程中线粒体的准备,以隔离submitochondrial颗粒,外膜或氧化磷酸化的净化单独的组件。所描述的方法是修改的标准协议隔离雅各和Saks 1。准备线粒体的预期收益率大约为10-15毫克每心脏线粒体蛋白质和苹果酸/谷氨酸等准备不同的呼吸控制率8至12国IV周围O 2的0.12μmolxmin -1 XMG蛋白呼吸-1 23 ° C中的介质,包括0.25 M蔗糖氯化钾,10毫米,0.2毫米EDTA,5 mM磷酸钾(pH值8.0)与150微米ADP启动国家第三呼吸(确切的实验条件和补充,见文献2)。
应特别注意隔离程序开始前的几个技术细节。它是使用干净的聚碳酸酯或聚丙烯离心管的关键,因此应彻底刷干净的热水,然而,洗涤剂治疗应保持在最低,洗涤管。此外,它是更好地收集一切必要的玻璃器皿和仪器在寒冷的房间隔离的前一天。
在隔离烧杯烧瓶传输缓冲区时,а特别注意应的解决方案,防止滴冰水。处理组织时,应该强调的,因为即使短期斩首的动物和冷却的组织之间的时间延迟将导致部分耦合线粒体进行了心脏提取应尽快。快速冷却,除去心中的彻底清洗是必须获得标准的编制,血红蛋白及红细胞NADase。
胰蛋白酶是降解结缔组织蛋白组织的易感性增加在均质剪切力。应避免长时间暴露在蛋白酶组织,因为它在质量低劣的线粒体结果。
经过高速离心,离心管的墙壁应该用纸巾擦拭,删除任何墙壁上积累的脂肪物质的存款。
对于最终的再悬浮,它是更好地使用,以低量的最终缓冲区,以尽量减少在储存过程中(150至200μL心每缓冲区)线粒体功能的丧失。运输二价阳离子的研究没有螯合剂必须在最后的准备,因此线粒体应清洗数次与EGTA无介质隔离后的第一个小时内使用。
The authors have nothing to disclose.
我们感谢作者介绍的线粒体生物学和许多有益的见解和意见,在此过程中领域的教授A.维诺格拉多夫和维拉Grivennikova博士。作者感谢夫人阿曼达McKintock从皇后大学媒体与视频准备的帮助办公室。