一次組織の二つのチミジン類似体の免疫蛍光検出（CldUとIDU）

1。 CldUとIDUとラベリング組織水のチミジン類似体（CldUまたはIDU）を溶かす。各化学物質1mgの/ mLを量り、蒸留水のガラスびんを分離するために追加。我々は通常、一度に各1リットルを用意。 攪拌プレートや攪拌機の他のフォーム上に化学物質を溶解する。 CldUは10分で溶解します。室温での撹拌。 IDUは37℃撹拌の時間°シェーカーでC以上のものが必要です。水源は、IDUの溶解性に影響を与えることができます。 IDUは一晩振とうした後、一時停止解除のままの場合、水のきれいなソースを試してみてください。溶液は4暗所で℃で保存されています。 希望の標識期間のためのマウスへの最初のチミジンを含む溶液を（CldUまたはIDUのどちらか）を管理する。マウスは、ラベルの期間中にラベルのない水へのアクセスを許可しないでください。指定された標識期間が完了すると、少なくとも24時間の未標識の水で洗い流して（類似物を含むチミジンは数時間の血清半減期を持っている）を開始。希望の標識期間のためのマウスへの2番目のチミジンを含む溶液を（CldUまたはIDUのどちらか）を管理する。定期的に補充する水はボトル脱水を防ぐために！ また、マウスはCdlUし、IDUのシーケンシャル腹腔内注射によって標識することができる。 10mgの/ mLの濃度でCldUまたはIDUを準備します。 IDUは、懸濁液中に行って激しく振盪続いて、濃水酸化ナトリウム溶液の滴下加算が必要になる場合があります。過剰の水酸化ナトリウムを追加しないでください。 IDUの10mLの溶液に水酸化ナトリウムの一滴で37攪拌の時間が続く°シェーカーにCを追加。ないソリューションの場合、水酸化ナトリウムの添加を繰り返す。腹腔内のスペースにgの体重あたり100mcgを注入する。 コントロールスライドは、このプロトコルのために不可欠です。その結果、我々は強く、研究者が、感度と特異性を確保するためのチミジンアナログラベルのいくつかのバリエーションを行うお勧めします。これらは、1を含める必要があります。のみCldUで標識したマウス、2。唯一のIDUで標識したマウス、3。順次CldUし、IDUで標識したマウス、4。順次IDUとしCldUで最初、逆の順序で標識したマウス;水だけで標識されたモックな5匹。 CldUとIDUとラベルに学習するときに、捜査官は常に関心の組織からのコントロールスライドの全5上記のセットとプロトコル全体を行うべきである。 2。組織の収穫、固定、およびスライドの準備適切な麻酔薬を使用して、致命的な過剰摂取を実行してから放血を経由してマウスを生け贄に捧げる。新鮮な組織を切除すると24時間4℃で4％paraformalehyde ° Cで固定する。埋め込み用に4℃で1時04分ホルマリンバッファーとストア° Cに組織を移す。 また、血液が体内から消去されるまで生理食塩水と左心室を経由してマウスを灌流して致命的な過剰摂取を実行し、その後直ちに4％パラホルムアルデヒドの30〜50 ccで灌流。埋め込むために4℃で1：04ホルマリン緩衝液での関心や店舗の組織を削除します。 組織の脱水とパラフィン包埋した後、5ミクロンの組織切片と充電スライド上で場所をカット。 ℃で16時間（下記の抗原の検索の手順と本質的な）スライドに組織の接着性を確保するために65でスライドを焼く。 3。脱水、透過処理、およびAntigen検索 5分、2つのキシレン槽にスライドを浸漬することにより過剰なパラフィンを取り除く。それぞれ。 100、95、90、80 70、50％：水で希釈したエタノールにスライドを浸漬することにより組織を再水和。 3分間スライドを浸す。各濃度で、100％で始まり、最終的な浸漬では50％に向かって行く。 5分間スライドを洗浄する。 1X PBSインチ 5分（新鮮毎回製）の0.2％のTriton – X溶液中にスライドを浸漬することにより細胞を透過処理。 マイクロ波組織の抗原賦活化のためのスライドを準備します。ソリューションは、蒸発損失を考慮してスライドの上部より5センチメートルを覆うように、十分なボリューム0.01M pH6.0のクエン酸ナトリウム緩衝液でガラスビーカーにスライドを配置。 マイクロ波は、解決策が沸騰するまでスライド（3-10分。フルパワー時）。解決策が徐々に沸騰するまで、消費電力を削減（10〜80パーセント）とさらに20分間継続する。解決策が遅い沸騰のまま確保するために定期的にマイクロ波をチェックしてください。 場所のビーカーは、ベンチトップでのスライドを含む、ゆっくりと室温、（約2時間）まで冷却することができます。 スライドは、温度計を用いて室温にいることを確認。 40分間1.5N HCLにスライドを浸し。室温で。 ウォッシュは、1 × PBS、5分で二回スライド。洗浄ごと。 4。一次と二次抗体それは、スライドは、プロトコル全体を通して非常に湿ったままであることが重要です。乾燥した組織は、はるかに自動になります蛍光、結果として得られる画像が使用できなくなっています。死ぬ防ぐために、一度に一つのスライドを処理する。 サークル（すなわち、ワックス）ペンをブロックする液体とスライド上の各セクション。 1 × PBSの容器に戻しスライドを置きます。 ウェットペーパータオルを置くことによって湿度の高いインキュベーションチャンバーを作ることは密閉プラスチック容器の底に平らに置いた。 1 × PBSで希釈した10％ロバ血清のブロッキング溶液を作る。完全なソリューションと各セクションをカバーすることが重要です。 1 × 1.5センチメートルの組織切片の場合は、セクションごとに溶液50​​マイクロリットルで十分です。 スライドのブロッキング溶液を追加。 1X PBSからスライドを外し、ゆっくりと乾燥したペーパータオルのスタック上にスライドの端をタップすることで、余分な液体を取り除く。場所は、インキュベーション室内のスライドと各セクションに10％ブロック溶液50マイクロリットルを追加してください。すべてのスライドを室温で1時間近くにコンテナとインキュベートを完了している場合。 IDUを検出する一次抗体の希釈を準備します。 1 × PBSで行われた5％ロバ血清で1:250の濃度でマウス抗BrdUを希釈する。スライドからブロックのソリューションをオフにタップして、インキュベーション室に戻って置きます。各セクションに、上記の一次抗体を追加し、4℃で一晩インキュベート℃、 高ストリンジェンシー洗浄を（CldUにマウス抗BrdU抗血清によって結合を最小限にする）準備。新鮮な低塩TBST緩衝液（; pH8.0の36mmのトリス、50mmの塩化ナトリウム、0.5％Tween – 20を）作る。あなたは、スライドのペアごとにバッファー40mLのが必要になります。各50 mLコニカルチューブにバッファーを40 mLを加え。スライドを追加する前に、37〜予熱解決策は、℃の一度に二人は、、インキュベーションチャンバーからスライドを削除する（組織サンプルが互いに離れて向くように）バックツーバックに配置して、過剰な一次抗体をオフにタップします。低塩TBSTとカバーで満たされたチューブにスライドを配置。 20分間チューブを振とうする。 37℃の温度で細菌培養インキュベーターを振っ° C、および225 rpmに設定した速度インチスライドを新鮮な1X PBSで2回洗浄する。 5分。洗浄ごと。 必要に応じて、CldUと組織抗原の検出のために次の一次抗体溶液を準備します。 1 × PBSで行われた5％ロバ血清で1:250の濃度でラット抗BrdUを希釈する。一次抗体溶液に濃度を作業で組織の抗原に対する一次抗血清を希釈する。 スライドの過剰1X PBSをオフにタップし、そしてインキュベーション室に置いてください。各セクションに一次抗体を加え、4℃で一晩インキュベート℃、 スライドを新鮮な1X PBSで2回洗浄する。 5分。洗浄ごと。 二次抗体溶液を準備します。 Cy2とロバ抗ラット1:250へとCy5ロバ抗マウス、5％ロバ血清を含む1X PBS溶液で1:500に希釈してください。組織の抗原抗血清の主な種を検出するためのCy3二次追加。また、二次抗体溶液で1:150にDAPI mLの/ 0.4mgストック溶液を希釈する。 スライドとインキュベーションチャンバー内の場所を過剰1X PBSをオフにタップします。各セクションに二次抗体溶液を追加し、室温で1時間インキュベートします。 スライドを新鮮な1X PBSで2回洗浄する。 5分。洗浄ごと。 スライドの過剰1X PBSオフをタップして、ゴールドアンチフェードマウントメディアを（dyanine色素でVectashieldを使用しないでください！）延長するとカバーガラスを付着する。気泡を除去するためにカバースリップを押してください。 4℃で保存します。 5。イメージングと解析高エネルギー光源、プラン – アポクロマート対物レンズ、および高効率の顕微鏡のカメラ（例えば浜松ホトニクスオルカER）を装備した蛍光顕微鏡画像の関心の組織を。 AMCA（DAPI）、Cy2と（CldU）、Cy3標識（組織抗原）、およびCy5（IDU）のチャンネルで画像をキャプチャ。単一のマルチレイヤーイメージファイルを作成するために画像をマージ。 正しく実行した場合、DAPI染色された核が均一に明るくなります。組織の抗原（例えばインシュリン）目的の細胞を明らかにする必要があります。 DAPIまたは組織抗原を染色する場合は、カバーガラスを除去し、二次抗血清のアプリケーションを繰り返すために一晩1X PBSで弱いまたは一貫性のない、没頭スライドです。 Cy3での組織の抗原に焦点を当てる。チャンネル間の切り替え、Cy2ととCy5チャネルでCldUとIDUの染色を確認してください。として過度のIDUとCldU共同陽性によって示されるマーカー、間の潜在的な交差反応性を探します。のみCldUまたはIDUを含む組織を探します。 CldUまたはIDU陽性核の欠如は、ラベルや染色技術的な問題を示している可能性があります。このケースでは、高度に複製組織（例えば、リンパ節）を探します。 画像を分析する。 DAPIと組織の抗原を含むレイヤーを表示します。利き手でのホワイトボードマーカーと非利き手におけるセルカウンタを使用して、ドライ消去マーカー（別名ホワイトボードのマーカー）と対照的なマークで、各核をマーク。興味の組織内でDAPI陽性細胞をカウント。総細胞数を記録します。マークを削除するには、乾燥した消しゴムを使用してください。レイヤーを表示するDAPI、組織の抗原、およびCldUを含むの。興味の組織内でCldU陽性細胞をカウント。記録CldU細胞数がマークを消去しないでください。組織抗原、CldU、およびIDUを含むレイヤを可視化する表示に変更。 CldU IDU二重陽性細胞をカウント。レコードの値は、すべてのマークを消去し、DAPI、組織の抗原、およびIDUが含まれる画層が表示されます。興味の組織内でIDUの陽性細胞の総数を数えます。 IDUの細胞数を記録します。 6。代表的な結果私たちは、順番に即時犠牲に続く二週間、のために一週間してから、IDUのためCldUで6週齢の雌マウスのラベルが付いた。膵臓はCldU、IDU、およびインスリン（組織抗原）だけでなく、DAPIを検出するために染色した。島は、一様にインスリンで染色した。 CldU染色された核は、IDU染色された核（図2）とは異なるであった。膵島の外に多くの核がCldU IDU共同陽性（図2、右下、白矢印）でした。単一のインスリン陽性細胞はCldUとIDU（図2、右下、マゼンタの矢印）の両方のための核染色を持っていた。 マウス。マウスを用いた全ての実験は、フィラデルフィアの小児病院のIACUC委員のガイドラインに従って行った。女性B6.129 F1野生型マウスは、PMIニュートリションインターナショナル（Richmond.インディアナ州）からフィラデルフィアの小児病院で実験動物施設で収容されたタコ（ジャーマンタウン、ニューヨーク）、、及び飼育マウス国会5015から購入した。 戦略のラベル付け。 CldU最初の細胞分裂のイベント（このスキームでは緑色のマーク）とIDU（この方式では赤マーク）で2番目の細胞分裂を標識することにより、CldUとIDU（緑/赤）の両方との共同で標識された細胞におけるシーケンシャル細胞分裂の結果。 マウス内の膵臓の細胞のターンオーバーのチミジン標識法の代表的な結果。中央のランゲルハンス島とマウスの膵臓の免疫蛍光像。マウスは、即時の犠牲の前に飲料水で2週間後、1週間やIDUに対してCldUで注入した。プロトコルで説明されているように膵臓のサンプルが処理されました。異なる層との組み合わせで最大40倍の目標の画像は、カウントに適して表示されます。マージされた画像はDAPI（白）CldU（緑）、IDU（赤）、インスリンを（黄色）が含まれています。 （上段、左）DAPIとインスリン。 （右上）CldUとインスリン。 （下、左）IDUとインスリン。 （下、右）CldU、IDU、およびインスリン。スケールバー：100μmの。 図1。ラベリング戦略。 CldU最初の細胞分裂のイベント（このスキームでは緑色のマーク）とIDU（この方式では赤マーク）で2番目の細胞分裂を標識することにより、CldUとIDU（緑/赤）の両方との共同で標識された細胞におけるシーケンシャル細胞分裂の結果。 図2。マウス内の膵臓細胞のターンオーバーのチミジン標識の代表結果。中央のランゲルハンス島とマウスの膵臓の免疫蛍光像。マウスは、即時の犠牲の前に飲料水で2週間後、1週間やIDUに対してCldUで注入した。プロトコルで説明されているように膵臓のサンプルが処理されました。異なる層との組み合わせで最大40倍の目標の画像は、カウントに適して表示されます。マージされた画像はDAPI（白）CldU（緑）、IDU（赤）、インスリンを（黄色）が含まれています。 （上段、左）DAPIとインスリン。 （右上）CldUとインスリン。 （下、左）IDUとインスリン。 （下、右）CldU、IDU、およびインスリン。スケールバー：100μmの。