Dieses Verfahren ermöglicht die Aufreinigung von DNA-Fragmenten mit hoher Ausbeute.
Gereinigte DNA-Fragmente werden für verschiedene Zwecke in Molecular Biology eingesetzt und sie können durch mehrere Verfahren hergestellt werden. Die meisten von ihnen erfordern eine vorherige Elektrophorese der DNA-Fragmente, um die Band von Interesse zu trennen. Dann wird dieses Band aus einem Agarose oder Acrylamid Gel ausgeschnitten und gereinigt, indem Sie entweder: Bindung und Elution aus Glas oder Silica-Partikel, DEAE-Cellulose-Membranen, "crush und genießen Methode", Elektroelution oder sehr oft teuren kommerziellen Aufreinigungskits. So wird die Auswahl einer Methode hängt vor allem von dem, was im Labor zur Verfügung. Die Elektroelution Verfahren erlaubt es, sehr sauber DNA in einer Vielzahl von Anwendungen (Sequenzierung, Radiomarkierung, enzymatische Restriktion, enzymatische Modifikation, Klonen usw.) verwendet werden zu reinigen. Dieses Verfahren besteht in Platzierung DNA-Bande enthaltende Agarose oder Acrylamid Scheiben in Probenvertiefungen der electroeluter, dann Anlegen von Strom wird das DNA-Fragment auf die Agarose zu verlassen und damit in ein Kissen Salz gefangen werden, um später durch Ethanolfällung gewonnen werden.
Die Dauer des Laufs wird in hohem Maße abhängig von der Größe der Fragmente, die normalerweise für Fragmente bis zu 20 kb 50 Minuten bis 1 Stunde ist genug, während für kleine Fragmente UV-Licht Überwachung alle 10 Minuten ist erforderlich, um das Fragment zu verhindern, um durch die go Salz Kissen und damit auf die anodische Pufferkammer abnehmender Erholung. Es ist wichtig, um sicherzustellen, dass, wenn Sie Ihr Netzteil, eingestellt auf 100 Volt, gibt es eine aktuelle mindestens von 10 MAMP. Die DNA-Bande kann durch Verwendung eines UV-Handlampe überwacht werden und erkennen, wenn diese verlässt das Gel in Scheiben schneiden. Das Polster Salz kann auch mit 3 M Na-Acetat werden.
Dieses Verfahren ermöglicht die Aufreinigung von DNA oder RNA-Fragmente unterschiedlicher Größe mit einer guten Erholung (~ 80%) auf radioaktiv werden, verdaut durch Restriktionsenzyme, verarbeitet durch modifizierende Enzyme, etc.
The authors have nothing to disclose.
Die Arbeit in Dr. Bermudez Labor wurde von CONACYT (Grant # 82622) gefördert. Wir danken Gabriela Gutierrez-Sosa, Eliuth Reyes-Martinez und Ximena Rodriguez-Torres für die Videoaufzeichnung der electroleution Verfahren.
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
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NdeI | New England Biolabs | R0111L | ||
HindIII | New England Biolabs | R0104L | ||
NH4 acetate | JTBaker | 0596 | ||
agarose | Invitrogen | 15510-027 | ||
Biophotometer | Eppendorf | 6131 000 020 | ||
Electroeluter | IBI | UEA CAT 46000 |