في هذه الورقة نقدم طريقة لزرع الخلايا الجذعية البشرية في مناطق مختلفة من الجهاز العصبي المركزي للجنين الدجاج. هذا يوفر<em> في الجسم الحي</em> نموذج لتقييم انتشار والتفريق بين أنواع مختلفة من الخلايا الجذعية البشرية في بيئات الأنسجة الجنينية.
الجنين الدجاج هو نموذج حيواني الكلاسيكية لدراسة التطور الجنيني الطبيعي والجنين واجراء تجارب زرع الأعضاء لدراسة سلوك الخلايا في موحد<em> في الجسم الحي</em> البيئة. المزايا الرئيسية للجنين الدجاج تشمل التكلفة المنخفضة ، وسهولة الوصول عالية ، وسهولة التلاعب الجراحية وعدم وجود نظام المناعة تطويره بالكامل. يمكن زرع الأعضاء في أجنة الدجاج تقديم معلومات قيمة حول تكاثر الخلايا ، والتمايز والسلوك ، والاستجابات من الخلايا لإشارات محددة في الأنسجة الجنينية محاريب ، ومكون للأورام محتملة. ويمكن زرع الخلايا في أجنة الدجاج أيضا أن يكون خطوة نحو تجارب زرع في النماذج الحيوانية الأخرى. وقد تم مؤخرا استخدام الأجنة الدجاج لتقييم إمكانات عصبية من الخلايا الجذعية البشرية والسلف بعد زرع في بدأة العصبية<sup> 1-6</sup>. نحن في هذا الفيديو توثيق الإجراء بأكمله لزرع الخلايا الجذعية البشرية في النظام العصبي المركزي النامية الجنين الدجاج. الإجراء تبدأ حضانة البيض المخصب حتى الأجنة في العصر المرجوة التي وضعتها. ثم يتم فتح قشر البيض ، ويتناقض الجنين عن طريق حقن صبغة بين الجنين وصفار البيض و. آفات صغيرة مصنوعة في الأنبوب العصبي باستخدام الجراحة المجهرية ، وخلق موقع على التجدد لترسب الخلايا التي تعزز التكامل اللاحقة في النسيج المضيف. نظهر حقن الخلايا الجذعية البشرية في مثل هذه الآفات التي أدلي بها في جزء من الأنبوب العصبي الذي يشكل الدماغ المؤخر والنخاع الشوكي ، وداخل تجويف الجزء من الأنبوب العصبية التي تشكل المخ. وتتجلى أيضا في حقن الأوردة الجهازية خارج الجنين والشرايين وسيلة بديلة لتقديم خلايا الأنسجة أوعية دموية بما في ذلك النظام العصبي المركزي. أخيرا نبين كيفية إزالة الجنين من بويضة بعد عدة أيام لمزيد من التطوير وكيفية تشريح النخاع الشوكي مجانا لاحقة تحليلات الفسيولوجية والنسيجية أو البيوكيميائية.
الجنين الدجاج هو نموذج حيواني مريحة وتنوعا للتجارب زرع الأعضاء. عدم وجود نظام المناعة وظيفية أثناء التطور الجنيني والجنين يسمح للبقاء وتنمية الخلايا من أي نوع من الأنواع التي تتحمل درجة حرارة الحضانة. وقد استخدمت أجنة الدجاج لاختبار إمكانات التجدد لأنواع مختلفة من الخلايا الجذعية (إعادة النظر في المرجع 15). الخلايا الجذعية الثدييات يمكن أن تدمج في أنسجة الجنين الدجاج بما في ذلك النظام العصبي المركزي ، حيث يمكن أن تؤدي إلى الخلايا العصبية التي محواري التوقعات ، يمكن تقييم اتصال متشابك والخصائص الكهربية في سياق وظيفي 1،2 الدارات العصبية.
لأن العمليات الجراحية سهلة نسبيا ، ويتم إجراء الحقن تحت البصرية بدلا من السيطرة التجسيمي ، يمكن بسهولة أن عدد الأجنة يمكن زيادة لاستيعاب ظروف تجريبية مختلفة في تجربة واحدة. يمكن عادة يتم حقن الخلايا في الأجنة 20-30 ضمن التجربة 4 ساعة. وفيات بعد حقن الأجنة هو العامل الرئيسي الحد. يجب اتخاذ الاحتياطات اللازمة لتجنب النزف والجفاف. أن ندرك أن هناك بعض مراحل تطور حاسم في معدل وفيات الأطفال الذي يزيد الطبيعية. المكمل للجنين مع عدد قليل من مل الدافئة ، حقن معقمة الدجاج المسابقة التالية وقبل يوم واحد مراحل النمو الحرجة ، فضلا عن ضمان أن نافذة في البيض جيدا مختومة وموجهة لتفادي تسرب ، ويحسن البقاء على قيد الحياة. إذا كان التسرب من خلال ختم الشريط يجب أن تحدث ، وإزالة الشريط ، تجفيف الأسطح وإعادة الشريط. بعض المحققين استخدام الشمع والزجاج أو البلاستيك coverslips لاغلاق النافذة. يجب أن معدل وفيات لن تكون مختلفة كثيرا في حقن مقابل الشام التي تديرها الأجنة.
على الرغم من أننا قد ركزت هنا على حقن الخلايا الجذعية البشرية في بدأة من الدماغ والحبل الشوكي ، ويمكن أيضا أن حقن الخلايا الجذعية في بدأة الأجهزة الأخرى (انظر على سبيل المثال المرجع 4). كل جهاز يطرح تحديات خاصة بها. على سبيل المثال ، يمكن حقنها في القلب يمكن أن يكون تحديا بسبب مقاومة ميكانيكية عالية على الاختراق وماصة بسبب الحركات ، والتي من ناحية أخرى يمكن أن تباطأ عن طريق التبريد الأجنة في درجة حرارة الغرفة قبل الحقن. ويجوز للأجهزة التي تفتقر إلى التجويف لا تستوعب كميات كافية من الحقن ، ويمكن بالتالي تتطلب آفة الجراحية لخلق وعاء. في تجربتنا ، بعد تجديد أنسجة الآفة هي ميزة لأنها تشجع على التكامل من الخلايا الجذعية البشرية في الأنسجة. ويمكن أيضا أن تكون خلايا اللحمة المتوسطة حقنها الجنينية مثل اللحمة المتوسطة في somitic تفريق أو العرف المهاجرة العصبية باعتبارها وسيلة لتحقيق إدماج المشتقات الوسيطة ، بما في ذلك قمة العقد العصبية المشتقة المحيطية 16،17.
The authors have nothing to disclose.
وأيد العمل من المنح المقدمة من Helse عوج Rehabilitering (JLB) ، ومجلس البحوث النرويجي (GH وحرس السواحل) وجامعة أوسلو (ناغورني كاراباخ وحرس السواحل).
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
Fluorescent microscope | Microscope | Olympus IX-81 | ||
Stereo Investigator | Program | MicroBrightField | ||
MIP-GFP mice | Mice | Jackson Laboratory | ||
Mathematica | Program | Wolfram | ||
Image J | Program | NIH | ||
Slidebook | Program | Olympus |