この可視化実験では、ライブ共焦点イメージングの実験のためにHIVの蛍光分子クローンを利用するためのガイドです。
融合することにより自分の好きなタンパク質に緑色蛍光タンパク質は、生物学者は、現在蛍光ビデオ顕微鏡を用いて生きている複雑な細胞プロセスを研究する能力を持っている。ヒト免疫不全ウイルスの細胞間の送信中にヒト免疫不全ウイルスのコアタンパク質の動きを追跡するために、我々はHIVの感染性分子クローンのコンテキストでGagタンパク質をGFP -タグ付きて、HIVのGag – iGFPと呼ばれる。我々は、ビデオ共焦点顕微鏡を使用してこのウイルスのクローンを研究する。以下の可視化実験では、我々はHIVギャグiGFPとヒトT細胞株をトランスフェクトし、我々は、蛍光標識した非感染CD4 + T細胞ウイルスの標的細胞として機能するを使用してください。我々は容易にウイルス学的シナプスと呼ばれる細胞間の構造を介してウイルスの生産と輸送を追うことができる異なる蛍光標識を使用する。シンプルなガス透過イメージング室は、私たちは数分から数日にライブ共焦点顕微鏡でシナプスを観察することができます。これらのアプローチは、彼らは一つの細胞から次へに移動するとウイルスタンパク質を追跡するために使用することができます。
ここでは、細胞 – 細胞からのHIVの伝達を可視化するための簡単な方法を説明します。我々の研究室と他者からの最近の研究では、これがT細胞の間に広がるHIVの主要なモードであることを示唆している。ここで説明する方法は、コア構造タンパク質、ギャグで遺伝的に符号化された緑色蛍光タンパク質タグを運ぶHIVのGag – iGFPと呼ばれるHIVの組換え形態を、採用しています。ために各ウイルス粒子の生産GFPの高いレベルから、HIVのこの複製コンピテントクローンは、リアルタイムで個々のウイルス粒子を追跡する研究が可能になります。このウイルスは、HIVのアセンブリと、細胞間伝達に関する研究で特に有用であると考えられる。
細胞間の転送によるHIVの転送は非常に効率的です。 3時間共培養時には、我々のルーチンは、フローサイトメトリーによって評価されるウイルスは一次T細胞の20〜30%に転送してください。同様の効率は質的に生細胞イメージングの間に見られている。ウイルスに感染したT細胞は、ほぼすぐに共培養開始後感染していない一次T細胞とシナプスを形成し始める。興味深い、すべての主要なT細胞は、レーザーピンセット(未発表の観察、GM)との強制相互作用にもかかわらず、HIV感染Jurkat細胞と対話する機能があります。 HIVギャグiGFPは間違いなく、in vitroおよび in vivo の両方で細胞間の伝達、に最も影響を受けやすいT細胞サブセットを決定するために有用であろう。
The authors have nothing to disclose.
このレビューはBKCに健康補助金の国立研究所、AI074420 – 02、バローズウェルカム奨励賞、Hirschlキャリア科学賞でサポートされており、NSFバイオフォトニクス科学技術センター、協力協定PHY012099、およびTHにUCDの保健システム研究賞がされたUCD CTSC NCRR ULRR024146。
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
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Jurkat T Cells | ATCC | |||
Leukocyte buffy coats from whole blood | New York Blood Center | |||
RPMI | Sigma | |||
Fetal Bovine Serum | Hyclone | |||
Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | |||
Nucleofector System and Solution V | Lonza | |||
EndoFree Maxi Prep Kits | Qiagen | |||
HIV Gag-iGFP plasmid | Chen Laboratory | |||
CD4+ T Cell Isolation Kit | Miltenyi Biotec | |||
Ficoll-Paque | GE Healthcare | |||
Celltracker/CellTrace Dyes | Invitrogen | |||
CO2-Independent Media | Invitrogen | |||
Imaging Chambers | Ibidi | |||
Olympus IX-71 Inverted Microscope | Olympus | |||
PlanApo N 1.42NA 60X oil objective | Olympus | |||
Innova 70C ArKr ion gas laser | Coherent | |||
CSU-10 Nipkow-type spinning disk confocal unit | Yokogawa | |||
Di01-T405/488/568/647-13x15x0.5 dichroic beamsplitter | Semrock | |||
525/50 bandpass filter | Semrock | |||
iXon+ 897 electron-multiplied charged coupled devise camera | Andor | |||
ASI 400 Thermostatic Heater | Nevtek |