رسم مصير الخلايا الجذعية الجنينية البشرية من خلال تكوين ورم مسخي

ويستند البروتوكول مكتوب أدناه على نشر المعلمات التي أوردها الكتاب ، مع بعض التعديلات. يتم تنفيذ البروتوكول مع موافقة الحيوان UCSF الرعاية المؤسسية والاستخدام (IACUC) والرقابة أبحاث الخلايا الجذعية (SCRO) اللجان. أولا ثقافة الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (hESCs) hESCs تنمو في مستوى جيد 6 (قطرها 3.5 سم الآبار) لوحات. 12 ساعة على الأقل قبل الركض الخلايا الليفية الماوس البذور الجنينية (MEF ؛ تم الحصول عليها من CF1 اليوم e12.5 الفئران الملقحة ، توقيت ، المشع في تسى 1000) الخلايا المغذية على لوحات مغلفة مع الجيلاتين 1 ٪ (6،7). وينبغي مطلي MEFs في التقاء 50-60 ٪ ، أو 4 × 10 5 خلايا في القطر 3.5 سم جيدا (الشكل 1). الخلايا عند مرور المستعمرات قد وصلت التقاء ~ 70 ٪ (الشكل 2). لمرور الخلايا ونمو KSR نضح المتوسطة (6) من الآبار واستبدال المتوسط ​​0.5 مل تحتوي على كولاجيناز الرابع في KSR بتركيز 1 ملغ / مل. احتضان لوحات مع كولاجيناز الرابع عند 37 درجة مئوية / 5 ٪ CO 2 لمدة 5 دقائق أو حتى حواف المستعمرات تبدأ من رفع اللوحة. إزالة كولاجيناز الرابع من لوحة ، وإضافة 0.5 مل من كل KSR جيدا ، وتتخلص من الخلايا لإزالة يدويا بالكامل من لوحة. جمع تعليق خلية من كل مكان ، وأيضا في أنبوب مخروطي 15 مل ، والسماح للخلايا لتسوية عن طريق الجاذبية لمدة 5 دقائق. إزالة طاف من الأنبوب ، وترك الخلايا والمتوسطة في إجمالي حجم 300μl ~. باستخدام 200 ميكرولتر pipettor الدقيقة التي وضعت في حجم كامل ، ماصة بلطف تعليق الخلية 5-6 مرات لتفريق المستعمرات. جلب تعليق خلية إلى إجمالي حجم 9 مل لكل بئر الأصلي من الخلايا باستخدام KSR المتوسطة (أي ، إذا كان أحد كذلك يتم حصاد ، الأنبوب يجب أن يحتوي على 9 مل). تكملة المتوسطة مع المؤتلف الإنسان الأساسية عامل نمو الخلايا الليفية (bFGF) إلى تركيز 12.5 نانوغرام / مل. بعد غسل الآبار الجديدة التي تحتوي على خلايا MEF (راجع الخطوة 2) مع الفوسفات Dulbecco ومخزنة المالحة (DPBS) لإزالة جميع المصل ، أضف 3 مل من التعليق الخلية إلى كل بئر واحتضان لوحات في 37 ° CO C / 5 ٪ 2. تغيير المتوسطة KSR مع ساعات بعد مرور 24 bFGF ، وحتى كل ساعة 24-48 الخلايا جاهزة للpassaged مرة أخرى. II. إعداد بيليه hESC للتطعيم في 24 ساعة قبل التطعيم ، إضافة إلى مثبط ROCK المتوسطة KSR إلى التركيز النهائي لل10μM لزيادة قابلية الخلية (8). وكذلك واحد من الخلايا في التقاء ~ 70 ٪ (5 × 10 5 الخلايا) إنشاء اثنين من الكريات ، مع اثنين من الكريات إدراجها في كبسولة الكلى. لإعداد الكريات خلية للتطعيم (9) ، واحتضان الصخرة المانع المعاملة مع الثقافات كولاجيناز الرابع لمدة 5 دقائق في 37 ° C CO / 5 ٪ 2. نضح كولاجيناز الرابع من البئر واستبدالها مع DPBS 1 مل مع 10 ٪ البنسلين / الستربتوميسين (القلم / بكتيريا). كشط المستعمرات يدويا من لوحة ، وشطف جيدا مع DPBS إضافية 1 مل مع القلم / بكتيريا ، ونقل كل قسامة 1ml التعليق الخلية إلى أنبوب مل microfuge 1.5. تدور أنابيب microfuge ز س فترة وجيزة في 8000 ، وطاف نضح ، وresuspend الكريات في DPBS 500μl مع القلم / بكتيريا. للمساعدة على ربط الخلايا معا من أجل زرع ، إضافة 100μl Phaseolus الشائع 1 ملغ / مل lectin (PHA) في DPBS لكل أنبوب. احتضان الخلية / التعليق PHA في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق ، ثم تدور لمدة 2 دقيقة في ز س 8000. استدارة 180 درجة داخل أنابيب آبارهم الدوار وتدور مرة أخرى لمدة 2 دقيقة في ز س 8000. نضح بعناية طاف بيليه ترك سليمة. إزاحة الكريات خلية من الأنابيب التي pipetting بلطف KSR 200μl بجوار حافة بيليه حتى المصاعد ببطء. طردت مرة واحدة ، ونقل على الفور إلى إدراج الكريات MILLICELL 0.4μm توضع في القطر 3.5 سم الآبار التي تحتوي على 3 مل KSR ، واحتضان لمدة 2 ساعة ليلة وضحاها إلى 37 درجة مئوية / 5 ٪ CO 2. III. كلوي كبسولة ترقيع تنفيذ كافة الإجراءات الحيوانية وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية المناسبة باستخدام تقنية العقيم. تخدير الفئران SCID البيج (CB17.Cg – Prkdc SCID Lyst BG / CRL) ، الذين تتراوح أعمارهم بين 8-12 أسابيع ، وذلك باستخدام مزيج من O2 3 ٪ استنشاق isoflurane/0.5 ٪ وثلاثي بروم إيثانول داخل الصفاق (آفيرتين ، و 25 ملغم / كغم الطازجة). وسيتم engrafted الكريات الخلايا اثنين في الماوس باستخدام تقنيات صفها (10). بعد وضع الماوس على وسادة تدفئة لمنع انخفاض حرارة الجسم ، حلق منطقة شق ، ثم تطهير بالكلورهيكسيدين. جعل شق 2.5 سم من خلال الجلد قبالة المركز ولكن بالتوازي مع العمود الفقري. إبقاء منطقة رطبة مع شق سالي العقيمةه ، وجعل أصغر شق طريق العضلات ، وأقل بقليل من أضلاعه و~ 1 سم من العمود الفقري. ينبغي أن تكون كبيرة شق بما يكفي لسحب عن طريق الكلى ، ولكن صغيرة بما يكفي أن الكلى لا تنزلق إلى تجويف البطن دون استخدام القوة. اسحب برفق الكلى من خلال شق العضلات باستخدام الزجاج ماصة باستير التي تم سحبها في شكل خطاف ، كليلة منحنية قليلا. الرطب في الكلى مع DPBS معقمة لمنع الكبسولة من الجفاف. هذا قد يكون من الضروري تكرار في جميع أنحاء الداخلي ، كما ان الكبسولة هشة للغاية. باستخدام الملقط دومون # 5 ، برفق الكبسولة حتى من الكلى وجعل شق 2 مم باستخدام مقص Vannas الربيع. مع آخر ماصة الزجاج التي تم سحبها إلى التحقيق ، ودفع غرامة جدا اضعافها ، وجعل جيب صغير بين الكبسولة والكلى. تلميح باستخدام ماصة فوهة واسعة وضعت على ماصة نقل القابل للتصرف ، واتخاذ واحد من الخلية بيليه إدراج MILLICELL. تأكد من أن تتخذ وسائل الاعلام اضافية قليلا على طول ممكن ، وسائل الإعلام الزائدة يمكن أن تتداخل مع نقل بيليه. بينما يمسك حافة شق لخلق جيب ، ومكان بلطف بيليه القادم لافتتاح ودفعها في اتجاه جيب قطب واحد في الكلى مع سحبت ماصة. كرر العملية مع بيليه الثانية. هذا المكان تحت الكبسولة في الكلى نفسها ، ولكن باتجاه القطب المعاكس. بعناية مكان الكبسولة يتراجع على الكريات. ينبغي أن الكريات البقاء داخل جيب ، ولا الخيوط الضرورية لإغلاق الكبسولة. دفع برفق الكلى مرة أخرى في التجويف البطني وإغلاق الجدار العضلي باستخدام خيوط الحرير 4-0 (أو أصغر) مع إبرة عكس القطع المرفقة. يجب أن تكون صغيرة بما يكفي شق أنه ليس هناك سوى واحد هو الخيط اللازمة. إغلاق الجلد مع سلسلة من 4-5 غرز انقطاع ، وذلك باستخدام مواد خياطة الجروح نفسه. قبل وضع الماوس مرة أخرى في قفصه ، ويدير 0.05 ملغم / كغم البوبرينورفين (11،12) و 5 ملغ / كلغ كيتوبروفين (12،13) ، ومسكنات قصيرة الأجل وطويلة الأجل ، على التوالي. يجب فقط أن تستخدم المواد الخاضعة للرقابة وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية. نقل هذا الحيوان مرة أخرى إلى القفص ، والسماح لها للتعافي من التخدير على وسادة التدفئة. هذا ينبغي أن يستغرق حوالي 20-30 دقيقة. مرة واحدة على الماوس المتنقلة تماما ، ويمكن إعادتها للحيوان مرفق الإسكان. رابعا. مسخي الحصاد ، وتثبيت sectioning في 8-12 أسابيع بعد الجراحة ، وينبغي أن يكون هناك بالكاد ملموسا مسخي قرب الكلى. سوف الكبيرة ، مملوءة بسائل الخراجات تطوير غالبا كذلك ، ابتداء من الساعة 6-8 أسابيع. قد تكون هذه سابقة تتطلب حصاد وإذا كانت تسبب الضيق للحيوان. منذ teratomas تنمو بمعدلات أبطأ من الأكياس ، ومع ذلك ، سوف تحتاج إلى الانتظار لأطول وقت ممكن للحصول على حجم كاف من مسخي للتحليل (أي ما لا يقل عن 8 أسابيع). إزالة الكلى ، مسخي ، وأية الخراجات المحيطة باعتبارها كتلة من الأنسجة من تجويف البطن باستخدام نفس النهج الجراحية التي تم الوصول إليها في الأصل الكلى (انظر القسم الثالث ، الخطوات 1-4 أعلاه). المكان كله كتلة من الأنسجة رفعه في أنبوب يحتوي على 10 ٪ مخزنة الفورمالين. السماح للمسخي لإصلاح بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية. في اليوم التالي ، إزالة مسخي من الأنبوب. تشريح بعيدا أي الخراجات والكلى أكبر قدر ممكن من دون الإضرار مسخي نفسه (الشكل 3). قد يكون خفض أكبر في النصف teratomas لتسهيل تشريح والتضمين. مسخي العملية باستخدام معيار البارافين – تثبيت التقنية. وحدة آلية متاحة (على سبيل المثال ، Shandon Hypercenter) : I. فلكس 80 ٪ كحول 2 ساعة II. فلكس 80 ٪ كحول 1 ساعة III. فلكس 85 ٪ كحول 1.5 ساعة رابعا. فلكس 95 ٪ كحول 1 ساعة خامسا الكحول 100 ٪ فليكس 1 ساعة سادسا. الكحول 100 ٪ فليكس 1 ساعة سابعا. الكحول 100 ٪ فليكس 1 ساعة ثامنا. واضح شعيرة 3 1 ساعة تاسعا. واضح شعيرة 3 1 ساعة X. واضح شعيرة 3 1 ساعة </TD> الحادي عشر. البارافين (TissuePrep) 2 ساعة الثاني عشر. البارافين (TissuePrep) 2 ساعة خامسا المناعية وتحليل جزءا لا يتجزأ من مرة واحدة في القسم ، والبارافين مسخي في شرائح المسلسل 5μm باستخدام مشراح دوارة ، وأبواب تطفو على الشرائح. قبل التلوين ، خبز الشرائح لمدة ساعة على الأقل. وصمة عار على الشرائح مع الهيماتوكسيلين ويوزين باستخدام أساليب معيارية لتحديد هياكل الأنسجة ممثل عن كل من الطبقات الثلاث الجرثومية الجنينية (الشكل 4) : I. الزيلين غسل 3-5 دقائق II. الزيلين 3-5 دقائق III. الكحول 100 ٪ 3-5 دقائق رابعا. الكحول 100 ٪ 3-5 دقائق خامسا 95 ٪ كحول 3-5 دقائق سادسا. 80 ٪ كحول 3-5 دقائق سابعا. يغسل الماء (عدة تغييرات) 2 دقيقة ثامنا. الخيشومية في الهيماتوكسيلين # 3 2-5 دقائق تاسعا. يغسل الماء (عدة تغييرات) حتى الماء يتدفق واضحة X. سكوت المياه (لنواة الأزرق) 3 دقائق أو أكثر الحادي عشر. يغسل الماء (عدة تغييرات) 1-2 دقائق الثاني عشر. يوزين Y 1 دقيقة الثالث عشر. يغسل الماء (عدة تغييرات) 30 ثانية الرابع عشر. 80 ٪ كحول 1 دقيقة الخامس عشر. 95 ٪ كحول 2 دقيقة السادس عشر. 95 ٪ كحول 2 دقيقة السابع عشر. الكحول 100 ٪ 3 دقائق الثامن عشر. الكحول 100 ٪ (نظيفة) 3 دقائق التاسع عشر. الزيلين 2 دقيقة أو أكثر XX. الزيلين 2 دقيقة أو أكثر شن ساترة على كل شريحة مع Permount. سادسا. ممثل النتائج الشكل 1. الطلاء المشع من الخلايا الليفية الماوس CF1 الجنينية كطبقة المغذية للزراعة hESCs غير متمايزة. MEFs هي مطلي في التقاء ~ 50 ٪ ، كما هو موضح هنا ، أو 4 × 10 5 خلية لكل قطرها 3.5 سم جيدا في صحن الثقافة 6 – جيدا. بار ، 100 ميكرون. الشكل 2. تزرع hESCs سبيل المثال الثقافة subconfluent من hESCs غير متمايزة على طبقة المغذية MEF. MEF على طبقات المغذية حتى متموجة ~ 70 ٪ ، كما هو موضح هنا ، ثم passaged كما هو موضح. بار ، 100 ميكرون. الشكل 3. مثال teratomas explanted. explantation بعد ، يتم إصلاح مسخي والكلى ، وأي نسيج التبعي ككتلة في الفورمالين ، ثم يتم قطع بعناية في الكلى والأنسجة التبعي بعيدا قبل التضمين في البارافين. الشكل 4. Teratomas المستمدة من hESCs غير متمايزة تحتوي على أنسجة ممثلة لجميع الطبقات الجرثومية الثلاث في الجسم الحي. مسخي A ، مثل واحد مبين في الشكل (3) ، وكان مقطوع وملطخة الهيماتوكسيلين ويوزين لتحديد الأنسجة الجنينية. hESCs تثير الأنسجة المشتقة من جميع الطبقات الثلاث الجرثومية الجنينية (الأديم الظاهر (A ، B) ، الأديم المتوسط ​​(C) ، الأديم الباطن (D). (A) الوليدة بنية الأنبوب العصبي. (ب) ظهارة حرشفية البدائية. (C) الغضروف محاط كبسولة من اللحمة المتوسطة مكثف. (د) هيكل الغدية المعوية. بار ، 100 ميكرون. طبع الصور بإذن من المؤلف. الشكل 5. ويمكن استخدام تحليل مسخي لتعيين مصير hESCs ، الموسومة غير متمايزة. وكما نشر سابقا (9) ، ويمكن استخدام مزيج من hESCs الموسومة تحديدا مع hESCs معلم لتعيين مصير الخلايا الموسومة في مسخي مقايسة التشكيل. وكما هو موضح هنا ، مختلطة hESCs غير متمايزة معربا عن علامة السطح ، CD133 ، والموسومة مع بروتين الفلورية الخضراء المعززة (eGFP) ، مع hESCs ، معلم غير متمايزة. واستخدمت هذه لتشكيل teratomas بواسطة كبسولة الكلوي ترقيع. التحليل المناعى للالهيماتوكسيلين والمقاطع مسخي يوزين الملطخة المضادة للأجسام المضادة eGFP يوضح مصير الأديم العصبي الظاهر من hESCs + CD133. تم تجهيز Teratomas كما في الشكل (4) وcounterstained المضادة للeGFP الأضداد (البني) في توطين مشتقات CD133 + + GFP الخلايا داخل الأنسجة. وقد لوحظت CD133 + الخلايا المشتقة من (الأسهم) في الأنسجة الجنينية الناجمة عن الأديم الظاهر ، ظهارة العصبية تحديدا (يسار) والناشئ الأنبوب العصبي مثل هياكل (يمين). بار ، 100 ميكرون. طبع الصور بإذن من المؤلف. الجيلاتين 0.1 ٪ خنزيري الجيلاتين 99.9 ٪ DPBS إضافة إلى DPBS الجيلاتين ، احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة أو حتى عن الجيلاتين يذهب الى حل ، وتعقيم فلتر (0.22μm) قبل استخدامها. MEF المتوسطة 10 ٪ مصل بقري جنيني (المؤهلة) والتعديل Dulbecco 90 ٪ متوسطة الأساسية (D – MEM) L – 1X الجلوتامين 1X القلم / بكتيريا فلتر تعقيم قبل الاستخدام. KSR (تبديل خروج المغلوب المصل) المتوسطة 20 ٪ بدل خروج المغلوب المصل 80 ٪ خروج المغلوب D – MEM L – 1X الجلوتامين 1X الأحماض الأمينية غير ضروري 0.1 ملم β – المركابتويثانول / 12.5 نانوغرام / مل bFGF فلتر تعقيم. المحل في 4 درجات مئوية ، ولكن الحار الى 37 درجة مئوية قبل إضافة إلى الخلايا. إضافة bFGF مباشرة قبل الاستعمال. رابعا كولاجيناز حل 1 ملغم / لتر في المتوسط ​​عن طريق وضع KSR عند 37 درجة مئوية لمدة 1-2 ساعات أو حتى عن مسحوق يذهب الى حل. فلتر تعقيم. AVERTIN 0.25 – ز 2،2،2 ثلاثي بروم إيثانول 0.25 مل 2 – 2 – الميثيل بيوتانول احتضان عند 37 درجة مئوية خلال الليل لشكل الحل 100 ٪. عدة ساعات قبل الجراحة ، وتمييع الحل إلى 2.5 ٪ والعمل به DPBS احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة لا تقل عن 1 ساعة. تصفية وتعقيم قسامة. ثلاثي بروم إيثانول هو غاية الحساسة للضوء ، وحماية حتى من الضوء في جميع مراحل التحضير والاستعمال. إعداد ما لا يزيد عن 12-24 ساعة قبل الاستخدام. البوبرينورفين 1 ملغ / مل حل الأسهم في الميثانول لتمييع 0،015 ملغ / مل حل تعمل باستخدام العقيمة H 2 O. المحل في -20 درجة مئوية لمدة تصل إلى 1 في الشهر. كيتوبروفين 0.5 ملغ / مل حل العاملة في DPBS إضافة DPBS ، بين عشية وضحاها في احتضان 37 درجة مئوية لمدة 1-2 ساعات أو حتى عن مسحوق يذهب الى حل. تصفية وتعقيم المحل في 4 درجات مئوية.