RNA transkript trans etkili RNA bağlayıcı proteinler (RBPs) çok sayıda aracılığı ile geniş posttranskripsiyonel düzenlemeye tabidir. Burada hassas ve transcriptome geniş bir ölçekte RBPs, RNA bağlayıcı siteleri tanımlamak için genellenememektedir bir yöntem mevcut.
RNA transkript yüzlerce RNA bağlayıcı proteinler (RBPs) ve microRNA içeren, genellikle bağımlı bir hücre tipi ifade ribonükleoprotein kompleksleri (miRNPs) ile etkileşim transkripsiyon sonrası gen düzenlemeye tabi Anlamak için bu RNA bağlayıcı faktörlerin etkileşimi bireysel transkript, in vivo protein-RNA etkileşimleri 1 gerekli olan yüksek çözünürlüklü haritalar yönetmelik nasıl etkiler.
Genetik, biyokimyasal ve hesaplama yaklaşımları bir arada genellikle RNA RBP veya RNA-RNP etkileşimleri belirlemek için uygulanır. Immunopurified RBPs ile ilişkili RNA'lar mikroarray (RIP-Chip) 2 transcriptome bir seviyede hedefler tanımlar, ancak uygulaması, kinetik istikrarlı etkileşimler ve sadece nadir durumlarda 3,4 RBP tanıma elemanı (RRE tanımlamanıza olanak sağlar karakterizasyonu ile sınırlıdır Uzun hedef RNA içinde). Daha doğrudan RBP hedef site bilgileri, in vivo UV crosslinking 5,6 çapraz RNA segment ve cDNA sıralama (CLIP) 10 izolasyonu takip immunoprecipitation 7-9 ile birleştirerek elde edilir . CLIP 11-17 RBPs bir takım hedefleri tanımlamak için kullanılır oldu. Ancak UV 254 nm RNA-protein çapraz bağlanma, düşük verimlilik, CLIP sınırlıdır ve çapraz bağ yerini zor arka planı olmayan-çapraz UV-çapraz hedef RNA segmentlerinde ayrı, sıralı çapraz parçaları içinde kolayca tanımlanabilir. RNA aynı zamanda örnek mevcut parçaları.
Biz, yüksek çözünürlük ve hücresel RBPs ve miRNPs transcriptome çapında bağlayıcı siteleri belirlemek için güçlü bir hücre tabanlı crosslinking yaklaşım geliştirdi ki dönem PAR-Klip (Photoactivatable ribonükleozit-Geliştirilmiş Crosslinking ve Immunoprecipitation) (Şekil 1A anahat yöntemi). Bu yöntem, canlı hücreler tarafından 4-thiouridine (4-SU) ve 6-thioguanosine (6-SG) olarak photoreactive ribonükleozit analogları, doğmakta olan RNA transkript içine eklenmesi dayanmaktadır. 365 nm UV ışık hücreleri tarafından Işınlama etkileşim RBPs photoreactive nükleozid etiketli hücresel RNA'lar verimli crosslinking neden olur. Ilgi RBP Immunoprecipitation çapraz ve coimmunoprecipitated RNA izolasyonu ile takip edilmektedir. Izole RNA, cDNA kütüphanesi dönüştürülür ve derin Solexa teknoloji kullanarak sıralı. CDNA kütüphaneleri PAR-Klip tarafından hazırlanan bir karakteristik özelliği de crosslinking kesin konumunu sıralı cDNA ikamet eden mutasyonların tespit edilebilir olmasıdır. sitidinin geçiş mutasyonlar adenozin guanozin 6-SG sonuçlarını kullanarak ise 4-SU kullanarak, çapraz dizileri timidin,. Çapraz dizileri mutasyonların varlığı mümkün bol hücresel RNA'lar türetilen dizilerinin arka plan onları ayırmak için yapar.
Çeşitli RNA bağlayıcı proteinler bir dizi yöntem Uygulama Hafner ve ark bildirilmiştir. 18
The authors have nothing to disclose.
Biz yararlı tartışmalar için Tuschl laboratuvar üyeleri teşekkür ederiz. MH Deutscher Akademischer Austauschdienst (DAAD) tarafından desteklenmektedir. Bu çalışma, İsviçre Ulusal Fonu Hibe MZ # 3100A0-114.001 tarafından desteklenen; TT bir HHMI araştırmacı, ve onun laboratuvarda çalışma NIH hibe GM073047 ve MH08442 ve Starr Vakfı tarafından desteklenmiştir.
Buffers and reagents
Growth medium HEK293 cells
4-thiouridine stock solution (1 M)
Doxycyclin stock (10 mg/ml)
1x NP40 lysis buffer
Prepare a stock of 5x buffer without DTT and protease inhibitors. Add DTT and protease inhibitor directly before the experiment.
Citrate-Phosphate buffer
IP-wash buffer
High-salt wash buffer
Dephosphorylation buffer
Phosphatase wash buffer
Polynucleotide kinase (PNK) buffer without DTT
PNK buffer
SDS PAGE loading buffer
2x Proteinase K buffer