Overview
Следующее видео описывает метод трансдукции для обозначения (пациент полученных ксенотрансплантов) опухолевых клеток PDX, который используется для введения лентивируса, выражающих зелено-флуоресцентный белок и люциферазы репортеров в опухолевых клетках in vitro.
Protocol
1. Трансдукция опухолевых клеток, полученных из PDX
- Центрифуга размежевыв опухолевые клетки при 300 г х 5 мин и ресуспен в 2 мл маммосферных средств массовой информации. Подсчитайте жизнеспособные клетки, используя trypan голубое исключение (Resuspend переваренные клетки в буфере мытья 5 мл и подсчитайте как жизнеспособные, так и не жизнеспособные клетки, используя trypan голубое исключение. Короче говоря, смешать 50 мкл клеток и 50 мкл трипан синий и рассчитывать трипан-голубой исключая клетки с помощью гемоцитометра).
- Приготовьте 10 мл маммосферных средств массовой информации, содержащих 8 мкг/мл полибрена (2 мл полибрена на мл мультимедиа).
- Определите объем, необходимый для 2 х 105 жизнеспособных опухолевых клеток. Клетки центрифуги по 300 х г в течение 5 мин, и повторно гранулы в 2 мл полибрена, содержащего средства массовой информации. Плита 2 х 105 жизнеспособных опухолевых клеток на колодец в 6-ну ультра-низкой приверженности ткани культуры пластины.
ПРИМЕЧАНИЕ: Это оптимальное количество клеток, необходимых для трансдукции с одним лентивирусный вектор.
ОСТОРОЖНО! Лентивирусные частицы и все расходные материалов, используемые с лентивирусными частицами, должны обрабатываться в соответствии с институциональными процедурами рекомбинантных биоопасных ДНК.
ПРИМЕЧАНИЕ: Лентивирусная трансдукция первичных клеток молочной железы сильно благоприятствует миоэпителиальным клеткам, что может привести к плохой маркировке светящихся клеток и отбору субпопуляций опухолевых клеток во время маркировки. - Инкубировать вирус с 200 мЕ/мл нейраминидазы при 37 градусов по Цельсию в течение 1 часа до трансдукции, чтобы увеличить привязку вирусных частиц к различным первичным подпопуляциям клеток и исправить для этого потенциального смещения.
- Добавьте лентивирусные частицы при 10 MOI (2 x 106 TU для 2 x 105 жизнеспособных клеток), если диссоциированные PDX клетки истощаются из клеток мыши Лине или обогащаются в клетках EpCam. Добавить лентивирусные частицы при 30 МВД (6 х 106 TU для 2 х 105 жизнеспособных клеток) при использовании необогащенных PDX-диссоциированных клеток.
ПРИМЕЧАНИЕ: Увеличенное МВД обеспечивает эффективную трансдукцию даже при наличии большого количества мусора и мертвых клеток в сырых экстрактах. Держите один хорошо с неоцеливой клетки, чтобы служить в качестве контроля за жизнеспособностью и эффективностью трансдукции. - Вихрь для смешивания вируса с клетками. Инкубационный при 37 градусах Цельсия, 5% CO2 на срок до 96 часов. Добавьте 500 мкл свежих средств массовой информации маммосферы через 24 часа после трансфекции. Клетки не прикрепляются к пластинам, не аспирируют мультимедиа.
2. Оценка эффективности трансдукции и повторной имплантации помеченных клеток у мышей с ослабленным иммунитетом
- Мониторинг экспрессии прослеживаемого маркера (GFP) каждые 24 часа с помощью флуоресцентного микроскопа при увеличении 10X.
ПРИМЕЧАНИЕ: Выражение GFP можно наблюдать уже через 24 часа после заражения, но в большинстве PDXS выражение GFP хорошо видно после 72 часов(рисунок 1). - Оцените эффективность трансдукции, оценив процент клеток GFP в общей нуме.
ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку культуры содержат опухолевые клетки, остаточные стромальные клетки и мертвые клетки в различной степени, скважины с 10% клеток GFP могут быть имплантированы в мышь-хозяина. - Передача трансфуцированных клеток из 6-хорошо пластин в 15 мл конической трубки. Добавьте 1 мл маммосферных средств массовой информации в колодец, чтобы собрать все клетки, оставшиеся позади. Место на льду.
- Добавьте 10 мл HBSS/hepes в трансдуцированные клетки и центрифугу при 300 x g в течение 5 мин, 4 градусов по Цельсию. Тщательно аспирировать супернатант и повторно в 50 мкл экстракт матрицы подвала (BME) на льду.
ПРИМЕЧАНИЕ: BME aliquots должны быть разморожены на льду, 1 - 2 часа до использования. BME затвердеет при комнатной температуре; держать на льду во все времена. - Загрузите BME-встроенные клетки в 0,5 мл инсулинового шприца, держите на льду и поднесите в животное учреждение для реимплантации мышей NSG.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Рисунок 1: Отслеживание эффективности трансдукции в диссоциированных клетках PDX. A) PDX-диссоциированные клетки, обогащенные для эпителиальных клеток человека (истощение Лине) через 24 часа после трансдукции с pSIH1-H1-copGFP-T2A-puro lentiviral частицами. B) PDX-диссоциированные клетки от отдельного эксперимента, без обогащения эпителиальных клеток, 72 часа после трансдукции с pHAGE-EF1aL-luciferase-UBC-GFP-W. Обе панели показывают живые клетки. BF: Яркие полевые изображения, бар представляет 50 мкм
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
DMEM/F12 (1:1) | Hyclone | SH30023.01 | |
bFGF | BD Biosciences | 354060 | |
EGF | BD Biosciences | 354001 | |
Heparin | Sigma | H4784 | |
B27 | Gibco/Thermo Fisher | 17504-44 | |
Anti-fungi-antibiotics | Hyclone | SV30010 | |
HBSS Red Ca2+/Mg2+ free | Hyclone | SH30031.02 | |
Hepes | |||
Cultrex | Cultrex | 3433-005-01 | Basement Matrix Extract (BME) |
30 °C shaker | NewBrunswick Scientific CO. INC | Series 25 Incubator Shaker |