La procedura che descriviamo si concentra esclusivamente su IM-MS analisi dei complessi proteici. Pertanto, suggeriamo che i ricercatori non conoscono con il campo di MS strutturali fanno riferimento alle fasi di preparazione del campione, calibrazione degli strumenti e MS e MS tandem procedure di ottimizzazione descritte in Kirshenbaum et al. Http://www.jove.com/index/details 2009. stp? ID = 1954. In generale, questo protocollo prevede basse concentrazioni micromolari del complesso (1-20 mM) in un buffer di volatili quali l'acetato di ammonio (0,005 – 1 M, pH 6-8). Dato che 1-2 microlitri sono consumati per nanoflussi capillare, suggeriamo 10-20 microlitri come un volume minimo, per consentire l'ottimizzazione delle condizioni di SM. Parte 1: L'acquisizione di uno ione di mobilità di massa spettrometria spettro Impostare lo spettrometro di massa sui seguenti modalità di funzionamento: Mobilità-TOF, l'acquisizione di ioni positivi, e V-mode. Accendere tutti i gas (API, Trappola e IMS). Usiamo N 2 per la separazione IM, e Ar per il Trap / trasferimento. Consigliati valori iniziali sono 1,5 ml / min per la regione Trap, e un flusso di gas di 24 ml / min per il dispositivo IMS. Impostare la m / z gamma di acquisizione. Per un complesso proteico sconosciuto, si consiglia l'uso iniziale di una vasta gamma di massa, che possono poi essere ridotto a valori desiderati. In parallelo, regolare il profilo di MS per la massima efficienza di trasmissione. Per complessi di grandi dimensioni, la gamma di massa acquisizione dovrebbe essere impostato da 1.000 – 32.000 m / z, e il profilo di MS su Auto. In caso contrario, il profilo può essere impostato secondo la seguente tabella: m / z abitano (%) rampa (%) 960 10 20 3200 30 40 10667 Controllare l'impostazione radiofrequenza e, se necessario, regolare di valori appropriati per i complessi di proteine di grandi dimensioni, così: Fonte Trappola IMS Trasferimento RF Offset 450 380 380 380 RF Gain 0 0 0 0 RF Limite 450 380 380 380 Applicare la tensione capillare (1,050-1,400 V) e la pressione nanoflussi bassa (0,00-0,03 bar). Una volta spray è iniziata, provare a ridurre la pressione nanoflussi ad un valore minimo. Inoltre, regolare la posizione del capillare, rispetto al cono. Regolare i parametri di acquisizione MS, di acquisire uno spettro ben risolto MS: il gradiente di pressione lungo lo strumento, e il cono di campionamento così come il cono di estrazione, pregiudizi, Trappola e Trasferimento impostazioni possibili, dovrebbero essere tutti ottimizzati (dettagliato nel associati JOVE protocollo Kirshenbaum et al. http://www.jove.com/index/details.stp?ID=1954 2009). Anche se questi parametri sono campione-dipendente, le condizioni che abbiamo usato per l'acquisizione di spettri MS delle masse di ioni diversi, dal peptide di complessi proteici, sono riportati nella tabella 1, (vedi anche Fig. 1).. Per ridurre al minimo l'attivazione del complesso cercare di ridurre gradualmente (in passi di 10 V ~) tensioni il cono campione, Trappola e pregiudizi senza modificare la posizione del picco. Una volta uno spettro di massa ottimale si ottiene il profilo temporale deriva deve essere regolato. Quando si analizzano gruppi di proteine, le condizioni ottimali sia per la mobilità di massa e le misure sono spesso incompatibili, quindi, è importante trovare il giusto equilibrio tra i due. Nel complesso, la trama mobilità ionica deve essere ottimizzata in modo tale che i picchi sono distribuiti su tutta la gamma tempo di deriva, ed il profilo di picco è liscio, si avvicina ad una distribuzione gaussiana (Fig. 2A, 2B). Picco significativo asimmetria può essere correlato a scarsa separazione di conformazioni multiple. Come regola generale, tre parametri, la velocità dell'onda T, T-altezza d'onda e la velocità del flusso di gas IMS possono essere adattati per ottimizzare la separazione mobilità. L'aumento della velocità dell'onda T amplierà il tempo di deriva profilo di distribuzione, mentre un aumento dell'onda T valori di altezza lo stretto. Allo stesso modo, aumentando il flusso del gas IMS si sposterà il profilo temporale deriva verso valori più alti (il minimo flusso di gas IMS dovrebbe essere di 10 ml / min). Vi consigliamo di lasciare due delle tre variabili a disposizione fissa, e ottimizzando il terzo fino a quando lo spettro IM è ben risolto (Fig. 2B). A tal fine, impostare la velocità dell'onda T e il flusso di gas a 250 m / s e 24 ml / min, rispettivamente. Poi, come punto di partenza, impostare l'altezza dell'onda T a 3 V e, in maniera graduale, esso aumenta con incrementi di 1 V. In generale, più grande ioni richiederà altezze dell'onda più alta. Di solito, non vi è alcuna necessità di modificare la pressione IMS, tuttavia, quando tensioni di polarizzazione che richiedono elevate per la regolazione, riducendo il gas IMS permetterà una diminuzione del valore della tensione di polarizzazione e, di conseguenza, una riduzione di attivazione delle proteine complesse. Nel complesso, risoluzione massima di 10-12 t / At può essere raggiunto. Quando le condizioni non sono ottimizzate (basso dell'onda T altezza o ad alta velocità dell'onda T e / o pressione alta IM), gli ioni non attraversare attraverso il dispositivo IM in modo efficace, e il loro viaggio può richiedere più il tempo necessario per lo ione prossimo pacchetto per essere rilasciato nella cellula mobilità. Come risultato, un pacchetto di ioni nuovo verrà rilasciato dalla regione Trappola prima che il pacchetto precedente è stato consegnato alla regione pusher. Questo porterà a un 'roll-over' effetto, in cui il picco osservato nella prima parte dello spettro tempo deriva è identica a quella degli ioni nel bordo tailing (Fig. 2C). Questo artefatto può essere eliminato aumentando la T-wave altezza, e diminuendo la velocità dell'onda T e pressione IMS. Inoltre, il tempo di rilascio Trappola può essere regolata. Inoltre, è importante verificare che l'altezza dell'onda T trasferimento è impostata su almeno 5 V. Per evitare la fuoriuscita di ioni verso la cella di IMS, si raccomanda che l'altezza trappola mobilità essere mantenuti a livelli massimi (30 V). Bassa velocità ed elevata ampiezza di trasferimento T-onde possono portare alla "increspature" del profilo di distribuzione deriva tempo (Fig. 2D). Questo artefatto si verifica quando la separazione mobilità degli ioni (ioni di arrivo / deriva tempo) non è mantenuta attraverso il trasferimento e regioni ToF, a causa di sincronizzazione parziale tra la frequenza e la spinta dell'onda T velocità di trasferimento. Per eliminare questo effetto, sia il tempo di spinta o il T-velocità dell'onda di trasferimento deve essere regolato. Poiché la frequenza pusher è in relazione alla gamma di massa, questo manufatto può ricomparire quando questo parametro è cambiato. Dell'onda T altezza esercita un effetto minore, anche se la sua riduzione può inoltre contribuire ad eliminare increspature. Una volta che i suddetti parametri sono ottimizzati, l'IM-MS dati possono essere acquisiti. Parte 2: Screening condizioni sperimentali per assicurare misure di mobilità delle strutture native Per raggiungere picchi molto risolto MS, complessi proteici sono spesso attivati nel spettrometro di massa, per promuovere la rimozione dei residui di acqua e componenti di buffer 11. Tuttavia, se l'energia di attivazione viene aumentata oltre il valore soglia, parziale svolgimento può essere indotta formando 12 diversi stati intermedi, che sono difficilmente corrispondono ai nativi, la soluzione a stato struttura (Fig. 3A-C). Di conseguenza, il picco tempo di deriva può essere spostato e ampliato, riflettendo la popolazione eterogenea di strutture spiegato. Al fine di ottenere dati in tempo deriva coerente con la soluzione fase strutture, è essenziale per controllare con attenzione le tensioni utilizzate per accelerare gli ioni, prima della separazione IM. Inoltre, per alta risoluzione MS è preferibile aumentare il trasferimento, piuttosto che la tensione di Trap. Come dispositivo di IM è posizionato, per prima, seguita dalla regione di trasferimento e l'analizzatore TOF, quindi, l'attivazione segue la misura IM e gli ioni rimane inalterato, mentre l'accuratezza MS può essere aumentata. Per convalidare che acquisizione dei dati è effettuata in condizioni di mantenere la struttura originaria del complesso, si raccomanda che i dati da registrare su una gamma di condizioni sperimentali e la soluzione, piuttosto che in base ad un singolo, ottimizzato serie di parametri: Aumentare il voltaggio del capillare e cono in modo graduale, monitorando l'effetto sullo spettro tempo di deriva. Come nella Fase 1, aumentare la tensione collisione Trappola in maniera graduale, e acquisire i dati a intervalli di 10 V. Per identificare le conformazioni spiegato e valutare i dati acquisiti, manualmente indurre dissociazione del complesso proteina titolando il campione con acido acetico in un range di pH 2-7, e registrare i dati (Fig. 3B). Parte 3: Correlazione tra i valori di tempo di deriva e di sezione A differenza di misure IM convenzionali, in cui i valori misurati tempo di deriva sono linearmente relative a Ω, nel T-wave sistema IMS, l'area della sezione trasversale è definita da un approccio di calibrazione. Così, piuttosto che una misura assoluta, una correlazione relativa esponenziale è generato tra i tempi di deriva misurato e 1,13 Ω: dove t D è il tempo di deriva misurato, e X è la costante proporzione che può essere estratto da una curva di calibrazione. La calibrazione è eseguireed misurando i tempi di deriva degli ioni con nota Ω (misurata dagli esperimenti IM convenzionale). Misure di tempo deriva sono calibrati utilizzando proteine denaturate equina citocromo C, cuore mioglobina cavallo e bovino ubiquitina con nota di collisione sezioni. A tal fine, le soluzioni di 10 micron di 49/49/2, rapporto volume, acqua / metanolo / acido acetico deve essere preparato (reagenti utilizzati sono riportati nella tabella 3). Acquisire IM-MS dati per le proteine calibrante sotto esattamente le condizioni lo stesso strumento utilizzato per la proteina bersaglio o complesso di proteine: (Parte 1). Tutte le tensioni ed i valori di pressione devono essere identiche, per preservare le impostazioni di separazione IM. Per ogni stato di carica delle proteine calibrante estrarre il valore sperimentale tempo di deriva (t D) (descritto nella parte 4). Corretta per ciascuno dei tempi deriva calibrante (t D) (Tabella 2) utilizzando la seguente equazione: , Dove m / z è la massa-di-carica rapporto tra lo ione osservato, e c è il ciclo di funzionamento avanzato (EDC) ritardo coefficiente 1. Il suo valore, tipicamente tra 1.4 e 1.6, è lo strumento-dipendente. Il valore di EDC è indicato all'interno del Sistema | Impostazioni di acquisizione | Acquisizione scheda Impostazione. Utilizzando Prof. David Clemmer Cross-Sezione del database: http://www.indiana.edu/ ~ Clemmer / Ricerca / croce% 20section% 20database/Proteins/protein_cs.htm 14 corretto ciascuno dei calibrante sezione trasversale sia per stato di carica di ioni e massa ridotta. , Dove Ω C è la corretta sezione, Ω è la sezione letteratura, z è lo stato di carica ionica, m è il peso molecolare dello ione calibrante, G e M è il peso molecolare del gas di fondo IM (tipicamente N 2). Nel plot (t D) contro In (Ω C) (Fig. 4A). La curva risultante corrisponde alla seguente equazione: I parametri X e A può essere estratta inserendo la trama di una relazione lineare. La X pendenza corrisponde al fattore di proporzione esponenziale e A rappresenta il fit-determinata costante. Calcolare il coefficiente di correlazione misura r 2, con la formula di Pearson: . Valori accettabili per r 2 sono maggiori di 0,95 (Fig. 4B). Un valore più basso coefficiente di correlazione può essere dovuta a: Svolgimento incompleta del calibranti proteine. Questo porterà a picco a causa di allargare l'assemblaggio eterogeneo di stati intermedi. Nella nostra esperienza, un campione di età compresa possono deteriorare gli spettri IM. Dissimili condizioni sperimentali utilizzate per le diverse proteine calibrante. In questo caso, riportando i dati per ogni proteina separatamente dovrebbe generare diversi coefficienti di correlazione, anche se ciascuno di essi deve essere superiore a 0,95. Dati rumorosi e scorretta levigatura e centraggio della distribuzione del tempo di deriva. Calcolo degli errori. Recorrect il tempo calibrante deriva utilizzando il fattore determinato esponenziale, X, derivato al punto 7: In una fase di validazione, replot Ω C vs e definire il coefficiente di correlazione. Valori superiori a 0,95 sono previsti. Secondo la procedura descritta al punto 4, correggere il tempo misurato deriva della proteina bersaglio o complesso di proteine: Calibrare il tempo di deriva del complesso bersaglio proteina / proteina utilizzando il fattore esponenziale, X, definito al punto 7: Calcolare Ω del complesso bersaglio proteina / proteina utilizzando il fit-determinata costante, A, definito al punto 7: . Per ogni condizione sperimentale, passaggi da 2 a 13 deve essere ripetuto. Nel definire l'area della sezione trasversale della proteina sconosciuta o complesso di proteine, si consiglia di ogni esperimento da ripetere almeno tre volte, e la deviazione standard di queste misurazioni triplice copia determinato. Parte 4: Definizione dei valori di tempo di deriva Software richiesto: MassLynx e Driftscope (Waters). Aprire l'IM-MS spettro utilizzando il software Driftscope. Dal menu principale selezionare View e Cromatogramma deselezionare, tempo di deriva e Spectrum (opzionale), lasciando attiva solo la visualizzazione mappa 2D tempo di deriva vs m / z. Dalla barra dei menu, scegliere Visualizza | Opzioni | Pannello Visualizza editor e regolare i valori di soglia di intensità di ridurre al minimo il rumore di fondo (in molti casi, questa impostazione può essere definito come% Min = 30-40 e Max = 100 conteggi%). Scegliere Visualizza | Mappa 2D scala di intensità, e appariranno tre opzioni: scala lineare, Log Scala e Scala radice quadrata. Una scelta di scala logaritmica (dati logaritmica trasforma) in grado di comprimere il codice del colore di intensità, e consentire la simultanea comparsa di una vasta gamma di intensità (in contrasto con le opzioni di radice quadrata e lineare, con cui solo i picchi più intensi sarà visibile) . Dal pannello di barra degli strumenti, utilizzare lo strumento pulsante di selezione. Questa opzione consente di attivare le varie opzioni di selezione, e consentire la selezione della regione interessata all'interno dello spettro. Lo strumento più preciso è Attiva Regione di selezioni interesse, per mezzo del quale un confine può essere tracciato intorno alla regione di interesse, escludendo così tutti i dati necessari e picchi di rumore. Allo stesso modo, le opzioni di selezione ortogonali e Band sono utili, quando la regione di interesse non è circondato da cime ridondanti. Una volta che la regione di interesse è selezionata, utilizzare il comando Accetta corrente selezione di rimuovere le informazioni non necessarie. Esportare i dati in MassLynx, pur mantenendo le informazioni tempo di deriva. All'interno MassLynx, aprire il cromatogramma dello spettro di deriva di risparmiare tempo, e combinare i bidoni tempo. Lo spettro di massa corrispondente si aprirà automaticamente. Applicare la funzione di lisciare definendo le dimensioni della finestra e il numero di parametri liscio (dovrebbe essere regolato in modo specifico per ogni spettro, utilizzando i valori minimi). Applicare sottrazione di base, se necessario. Centro dello spettro e misurare la massa, per convalidare l'identità delle proteine e la precisione di massa. Per ogni stato di carica, combinare la m / z gamma. Il corrispondente spettro di tempo di deriva apparirà automaticamente. Liscio e il centro del tempo deriva profilo, e definire il valore del tempo deriva indicando il baricentro di ogni picco. Parte 5: Risultati Rappresentante Figura 1. Rappresentazione schematica dello strumento Synapt HDMS indicando i parametri principali sintonizzabile di IMS-MS acquisizione. Parametri sperimentali utilizzati per IM-MS misurazioni sono etichettati in base alla loro posizione all'interno dello strumento. Il fascio di ioni è colorato in rosso, e la pressione in ogni regione è designato con un codice a colori. Il pannello in basso mostra il gradiente di potenziale lungo lo strumento e le differenze di potenziale che definiscono la trappola e le energie di collisione di trasferimento così come il potenziale di Bias. Tutte le potenzialità di lettura spalle si fa riferimento alla tensione di offset statico che di solito è impostato su 120V. Figura 2. Mobilità ionica tempo distribuzioni arrivo per la proteina Gβυ. A. Una elevata velocità dell'onda T-porta ad una stretta distribuzione del profilo tempo di deriva. La trama illustra la distribuzione del tempo di arrivo Stati di carica 16 + (rosso), 15 + (verde), 14 + (blu), e 13 + (magenta), così come il profilo tempo totale di deriva (in nero) della proteina G βυ. B. Una volta ottimizzato spettro deriva con una superficie liscia forma del picco gaussiano. Etichette colore simile in A. C. Un 'roll-over' effetto, che si verifica quando il tempo impiegato per gli ioni di attraversare la cellula mobilità è più lento rispetto l'intervallo tra le iniezioni di nuovi pacchetti di ioni nel dispositivo. Di conseguenza, esteso picco tempo di deriva appare all'inizio dello spettro. Questo effetto può essere eliminato aumentando la T-wave altezza, e diminuendo la velocità dell'onda T e pressione IMS. D. artificiale 'onde' sono causati quando il T-velocità dell'onda di trasferimento e la frequenza pusher sono parzialmente sincronizzati. Questo effetto può essere superato regolando sia la frequenza pusher o Bonifico T velocità dell'onda. Figura 3. L'effetto di attivazione di ioni e condizioni di parziale denaturazione su IM-MS spettri di emoglobina. Plot del tempo di deriva rispetto a m / z per il complesso emoglobina tetramerica, utilizzando una soluzione acquosa di 10 mM ammonio acetato (pH = 7.6) (A, C) e l'aggiunta di 0,1% di acido acetico (B). I dati acquisiti mediante collisione tensione trappola energetica di 13 V (A, B) e 35 V (C) Anche se in tutti e tre i pannelli lo spettro di massa (proiettata in alto) è simile, con una serie di carica tetramerica centrato a 4.000 m / z, il profilo temporale deriva (proiettato sui lati) è diverso (per un totale di distribuzione è tempo di derivain nero, e il 16 profilo + è in rosso). Il tempo di deriva più lunga del campione parzialmente denaturato, ottenuta in B, e la fase gassosa ioni attivati, ottenuto in C, è indicativo di un certo grado di dispiegarsi. Questa osservazione dimostra che anche se la massa misurata corrisponde a un complesso intatta, la sua struttura soluzione è interrotto. Di conseguenza, attento controllo delle condizioni sperimentali è richiesto. Figura 4. Generando una curva di calibrazione, la deriva misure di tempo e di collisione sezioni possono essere correlati. A. Valori deriva momento gli stati di carica multipla di equino citocromo C (circoli), il cuore mioglobina cavallo (triangoli) e bovina ubiquitina (quadrati) sono state rilevate in letteratura i valori corretti per Ω sia stato ioni di carica e massa ridotta. L'adattamento produce una funzione lineare, corrispondente: ln (Ω C) = XLN (t D ') + A. Il fattore determinato esponenziale (X), fit-determinata costante (A), e il coefficiente di correlazione vengono visualizzati sul grafico per i dati acquisiti in un T-velocità dell'onda di 350 m / s, e una altezza d'onda statica di 11 V. B. Un istogramma della distribuzione del coefficiente di correlazione ottenuto da 10 esperimenti di calibrazione consecutivi. Proteine del campione / Parametri tecnici GluFibrino- peptide monomero 1,6 kDa Mioglobina monomero 17 kDa Emoglobina tetramero 67 kDa Transferrina monomero 80 kDa GroEL 14-mer 801 kDa Supporto di pressione, mBar 4,4 5.0 5,1 5,1 6,5 Trappola di pressione, mBar 1.6×10 -2 2.4×10 -2 2.4×10 -2 2.6×10 -2 2.8×10 -2 IMS pressione, mBar 4.4×10 -1 4.4×10 -1 4.4×10 -1 4.4×10 -1 4.2×10 -1 Campionamento tensione di cono, V 46 80 80 80 118 Estrazione tensione di cono, V 1,7 1 1 1 3 Bias di tensione, V 20 20 25 25 50 Trappola energia di collisione, V 20 15 15 15 80 Trasferimento di energia di collisione, V 5 12 12 12 15 Tabella 1. Condizioni sperimentali utilizzati per l'analisi di macromolecole. Proteine di serie Massa molecolare (m) Oneri (z) m / z Collisione sezione trasversale (in 2) Citocromo C 12213 10 1222,3 2226 11 1111,3 2303 12 1018,8 2335 13 940,5 2391 14 873,4 2473 15 815,2 2579 16 764,3 2679 17 719,4 2723 18 679,5 2766 Mioglobina 16952 11 1542,1 2942 12 1413,7 3044 13 1305,0 3136 14 1211,9 3143 15 1131,1 3230 16 1060,5 3313 17 998,2 3384 18 942,8 3489 19 893,2 3570 20 848,6 3682 21 808,2 3792 22 771,6 3815 Ubiquitina 8565 8 1071,6 1442 8 1071,6 1622 9 952,7 1649 10 857,5 1732 11 779,6 1802 Tabella 2. Calibrante proteine e la loro collisione sezioni i valori determinati dal convenzionale tranne del IMS 14. Dispositivi Azienda Numero di catalogo Synapt HDMS-32K generatore RF Acque Ltd. P-97 Flaming-Brown micropipetta estrattore Sutter Instruments P-97 Sputter coater Electron Microscopy Sciences EMS550 Microscopio binoculare Nikon Reagenti Azienda Numero di catalogo Acetato di ammonio Sigma-Aldrich Sigma, A2706 CsI 99,999% Sigma-Aldrich Aldrich, 203033 Metanolo Sigma-Aldrich Fluka, 34966 Acido acetico Fisher Scientific AC12404 Equine mioglobina (da cuore a cavallo) Sigma-Aldrich M1882 Equine citocromo c (da cuore a cavallo) Sigma-Aldrich C-2506 Bovina ubiquitina (dai globuli rossi) Sigma-Aldrich U6253 Emoglobina Sigma-Aldrich H2625 Gas Commenti Azoto, purezza del 99.999% 8 cilindri metro cubo Argon, 99,999% puro 8,8 meterscylinder cubi Tabella 3. Reagenti e attrezzature.
