Riavviare diretta di una forchetta di replica in stallo da un Head-On polimerasi RNA

Questo metodo è stato utilizzato nella ricerca riportata in Pomerantz e O'Donnell, Science 327, 590-592 (2010) . 1. Assemblaggio di un complesso RNAP fermato allungamento è stato eseguito come segue: 500 nM concentrazione finale di E. RNAP coli σ 70 Egli è stato mescolato con concentrazione del 5 nM finale di un modello di DNA biotinilato 3,6 kb che contiene il T7A1 promotore in 100 ml di tampone A (20 mM Tris-Cl (pH 7,5), 8 mM MgCl 2, 0.5 mM EDTA, 5 mM DTT, 10% glicerolo) per 10 minuti a 37 ° C. 100 mM di Apu e 40 mM ognuno di GTP, ATP e CTP sono stati aggiunti per altri 10 minuti a 37 ° C. 2. Immobilizzazione del complesso RNAP fermato allungamento su perline streptavidina è stata effettuata come segue: 200 ml di streptavidina sfere magnetiche patinata (Invitrogen) sono stati aggiunti alla reazione sopra per 10 minuti a temperatura ambiente. 3. Purificazione del complesso immobilizzato RNAP fermato allungamento è stato effettuato come segue: Le perle (da sopra) sono state lavate 5 volte con 0,9 ml di tampone A contenente 0,75 M di NaCl, 200 mg / ml di eparina, e 20 mg / ml ssDNA (Il surnatante è stato rimosso dopo ogni fase di lavaggio, di separazione magnetica.) Successivamente, la perline sono stati lavati 2 volte con 0,9 ml di tampone A. 4. Formazione di una forchetta replica a valle rispetto alla testa-on RNAP è stata eseguita come segue: Le perle (da sopra) sono stati risospesi in 100 ml di New England Biolabs buffer di 4 e 10 unità di Sap I (New England Biolabs) è stato aggiunto per 10 minuti a 37 ° C. Le perle sono stati lavati 3 volte con 0,9 ml di tampone A e poi risospeso in 50 ml di tampone T4 rapida reazione Legatura (New England Biolabs). 2 l di rapida ligasi T4 (New England Biolabs) è stato aggiunto insieme con 6 nM concentrazione finale di pre-ricotto DNA biforcuta (RP10, RP22, RP25) per 10 minuti a temperatura ambiente. Le perle sono stati lavati 3 volte con 0,9 ml di tampone A. 5. Assemblea dei replisoma e inizio della sintesi filone che porta al bivio replica è stata effettuata come segue: 448 pmol di DnaB (come esamero) è stata incubata con la 150 microlitri perle di tampone A (20 glicerolo mM Tris-Cl (pH 7,5), 8 mM MgCl 2, 0.5 mM EDTA, 5 mM DTT, 10%) per 30 s in 23 ° C. 4,9 pmol di Pol III * (Pol III HE meno β), 15 pmol di β, 2 mM ATP, e 60 mM ciascuno dei dGTP e dATP sono state aggiunte ad un volume di 200 l ed incubati per altri 5 minuti a 37 ° C. La replica è stata aperta in seguito l'aggiunta di 10 mcg SSB e 24 mM ognuno di dATP e dTTP con [α-32 P] dTTP e [α-32 P] dCTP (attività specifica, 3.000-5.000 cpm / pmol) ad un volume finale di 250 microlitri. Reazioni sono state terminato dopo 10 minuti su l'aggiunta di 12 ml di 500 mM EDTA. 6. Purificazione e concentrazione del radio-prodotti contrassegnati DNA è stata eseguita come segue: Le perle (da sopra) sono stati bolliti dopo la reazione è stata interrotta al fine di rimuovere il DNA dalle perline. Qualsiasi residuo di DNA che rimangono aderenti al perline è stato rimosso trattando le perle con proteinasi K in un volume di 10 ul per 30 minuti a 50 ° C. Le perle sono state poi bollito e il surnatante è stato rimosso dalla separazione magnetica. Il supernatante combinato contenente il DNA è stato purificato utilizzando il kit di pulizia Qiagen PCR. Purificato radio-marcato DNA dei prodotti sono stati poi analizzati in un gel alcalino di agarosio. Replica * in assenza di uno scontro RNAP fermato complesso allungamento è stata eseguita come sopra, però, σ 70 è stato omesso. Rappresentante dei risultati: Collisione del replisoma con una testa-on RNAP risultati di solito in due prodotti di 2,5 kb e 3,6 kb di lunghezza. Da 2,5 kb prodotto rappresenta la lunghezza del DNA dalla forcella al RNAP fermato ei risultati replisoma stallo sulla collisione con il RNAP. Il prodotto 3,6 kb rappresentare tutta la lunghezza del DNA e dei risultati sia da occupazione incompleta del promotore da parte RNAP o parziale replisoma lettura tramite del capo-on RNAP. Un buon risultato o accurata dimostra che circa il 50% full-length del DNA viene prodotto. Tuttavia, in alcuni casi meno occupazione del promotore da RNAP verifica e una più alta percentuale di full-length del DNA si osserva quanto una popolazione maggiore di replisomes non incontrano uno scontro RNAP. Replica in assenza di un RNAP fermato in un solo full-length del DNA (3,6 kb). Figura. 1 Il replisoma è impedita da una testa-on RNAP. (A) di setup sperimentale. A E. coli RNAP complesso allungamento fermato è stato montato su un DNA biotinilato contenente il promotore T7A1 come descritto in precedenza (9). In breve, un complesso allungamento fermato è stato formato da 20 bps a valle del promotore incubando oloenzima RNAP con il DNA biotinilato per 10 minuti seguita dall'aggiunta di Apu, GTP, ATP e CTP per altri 10 min. Perline streptavidina sono stati aggiunti per altri 10 minuti poi le perle sono state lavate cinque volte ciascuna con 0,9 ml di tampone contenente 0.75M NaCl, 200 mg / ml di eparina, e 100 nM a singolo filamento di DNA per rimuovere instabile RNAP-DNA complessi e NTP in eccesso . Il DNA è stato poi digerito con Sapi, lavato, e legato ad una pre-ricotto DNA biforcuta. Le perle sono stati lavati di nuovo prima del montaggio del replisoma. Il promotore si trova a 2,5 kb dalla forcella ed è orientato alla trascrizione diretta verso la forcella. (B) DnaB è stata aggiunta poi la replisoma è stato assemblato e replica è stato avviato sia in presenza (corsia 2) o assenza (corsia 1) di un a testa alta RNAP.