1. Подготовка и подсчета Namalwa клетки Удалить клетки от культуры колбу и центрифуги клетки гранул. Удалить супернатант и ресуспендирования клеток в известном объеме PBS. Клетки, используемые в настоящем Протоколе подвески клеток. Если вы используете прилипшие клетки необходимо trypsinize перед сбором. Для определения количества живых клеток, пятна аликвоту суспензии клеток путем смешивания 1:1 с 0,4% трипанового синий раствор и пипеткой 10 мкл смеси на подсчете слайд, а затем вставить слайд в TC10 автоматизированных ячейки Счетчик (Bio-Rad Laboratories, Inc). TC10 ячейки счетчик будет автофокуса для обеспечения наиболее точного подсчета, а затем продолжить подсчет. Она автоматически определяет плотность живых клеток и общего числа клеток в исследуемом образце. Выберите вид изображения для отображения ячеек на экран. Затем выберите разбавления калькулятор, чтобы иметь TC10 счетчик ячейки автоматически рассчитает количество Смесь клеток, которые будут необходимы. Этот эксперимент является использование общей сложности три siRNAs: один миРНК контроль и два различных siRNAs ориентации STAT6 гена, плюс untransfected управления. Для этого необходимо 3,6 мл при конечной концентрации 5 х 10 6 клеток на мл. Введите нужной концентрации и конечные значения объема в разведении калькулятор, и он вычисляет объем клеточной суспензии необходимо на основе живых количества клеток для этого образца. Кроме того, выполнение расчетов вручную. Затем перенесите необходимый объем клеточной смеси для этих экспериментов в новую трубу. Спиновые ячейки смеси для осаждения клеток и удалить все PBS. Ресуспендируют в 3,6 мл гена Pulser электропорации буфера (Bio-Rad Laboratories). Передача 800 мкл аликвоты в пробирки, содержащие соответствующие siRNAs и аккуратно перемешать. Клетки готов к электропорации. 2. Electroporating клеток в 96-луночных 96-луночного электропорации пластина позволяет репликацию для всех четырех процедур для электропорации вместе. Передача 150 мкл суспензии клеток в соответствующие лунки 96-луночного электропорации пластины. Вставьте пластину в пластине камеры электропорации MXcell и закрыть крышкой. Electroporate с использованием настроек, оптимизированный для клеточной линии и буфера используется. Эти клетки электропорации использованием экспоненциальной волны затухают с инструментом настройки 250 В, 350 мкФ и 1000 Ω сопротивление. После электропорации завершения пипетку вверх и вниз мягко в каждой лунке смешать, а затем передать клеткам пластины культуры тканей содержащих подогретого СМИ. Namalwa клетки выращивают в RPMI (Life Technologies) с добавлением 7,5% FCS и 1% пирувата. Контрольные образцы, которые не были электропорации взяты из оставшихся клеточной суспензии и добавляли к культуре блюда подогретого культуральной среде идентично электропорации клеток. Инкубируйте клетки ночи при 37 ° C с 5% CO 2. Через 24 часа, один набор клеток, индуцированной с 10 нг / мл, конечная концентрация рекомбинантного IL-4 (R & D Systems). Второй набор контрольных клеток только получить дополнительные средства массовой информации. Все клетки инкубируют еще 24 часа при температуре 37 ° С и 5% СО 2. 3. Извлечение и проверить РНК После общей сложности 48 часов роста, граф клеток в каждой лунке, и передать один аликвоту из каждой лунки, чтобы микроцентрифужную трубки для экстракции РНК, и заморозить второй аликвоту для западных промокательной или другой белок анализа. Центрифуга для образцов гранул клеток, а затем удалить и уничтожить супернатант из каждой пробирки. Приступить к добыче РНК. Обычно мы используем общий Aurum РНК комплект (Bio-Rad) в соответствии с включен протокол. При мониторинге миРНК опосредованного нокдаун гена особенно важно для проверки качества, потому что РНК деградированных РНК даст ошибочные результаты. 260/280 отношения не указывает РНК целостности поэтому важно, чтобы запустить образцов на гель или микрожидкостных устройств для подтверждения РНК не деградировали. Для оценки качества и количества за один шаг, эти образцы будут проанализированы с помощью электрофореза Experion автоматизированной системы (Bio-Rad). Во-первых, тепло образцов. Затем премьер, нагрузки, и вихревые чип Experion РНК. Вставьте чип в станции электрофореза Experion и начать работать. После запуска завершен, программное обеспечение Experion будет автоматически отображать результаты в виде electropherogram, таблицы результатов (который отображает концентрацию РНК, рибосомных отношение, а показатель качества РНК номер), и виртуальные гель (который похож на традиционного РНК гель). Высокое качество общего образцов РНК, как правило, имеют RQI в 8-10. </LI> 4. ПЦР в реальном времени После проверки качества РНК, приступить к кДНК реакций. Этот эксперимент использовали iScript один шаг RT-PCR смеси (Bio-Rad), чтобы объединить синтеза кДНК и ПЦР в реальном времени в одной реакции. Сделать мастер смеси, содержащие все компоненты реакции, кроме шаблонов РНК для каждого праймера множество, и распространять эти в пластину ПЦР. После разбавления РНК равномерную концентрацию, добавьте РНК образцы соответствующие лунки. Каждая реакция устанавливается в трех экземплярах. Печать пластины, и поместить его в CFX384 ПЦР в реальном времени системы (Bio-Rad). Выберите соответствующий протокол и начать работать. После запуска завершен, экспрессии генов определяется путем сравнения экспрессии генов гена нормированная на ссылку гена в клетках электропорации с экспериментальными миРНК к тому же нормализация клетки электропорации с контролем миРНК. 5. Анализ миРНК нокдаун Выражение CCL17 было контролировать с помощью количественной ПЦР в реальном времени исследовать роль транскрипционного активатора STAT6 в IL-4 зависимой индукции CCL17. Для этого эксперимента GAPDH был использован в качестве ссылки гена. Альтернативные генов ссылки или нескольких генов ссылки могут быть использованы в том же порядке. Программное обеспечение CFX менеджер автоматически нормированного CCL17 выражения экспрессии гена ссылка из того же образца и автоматически сравниваются результате нормированные значения для контроля лечения, просто выбрав GAPDH как "ссылки" и контроль лечения (контроль миРНК без IL-4 индукции), как "контроль" в окне параметров эксперимента программного менеджера CFX. Без IL-4 индукции транскрипции CCL17 остается на низком, учредительные уровне, сопоставимом с контролем лечения. Клетки с индуцированной IL-4 и сохранение нормальной STAT6 пути (то есть, контроль миРНК или untransfected процедур контроля) показал 8-10 раз индукцию CCL17 выражения. Клетки с индуцированной IL-4, но с STAT6 выражение подавляется введением либо STAT6 миРНК показал лишь около 2 раза выше, чем выражение CCL17 uninduced клетки подтверждающие роль STAT6 в IL-4 индуцированной экспрессии CCL17. 6. Представитель Результаты Рисунок 1. Обзор IL-4 сигнальный путь. ) Связывание IL-4 со своим рецептором приводит к димеризации и активации STAT6. Активированный STAT6 перемещает в ядро и активирует транскрипцию генов-мишеней его, например, CC17. Б) без IL-4 индукции транскрипции CCL17 останутся на низких, учредительные уровнях. C) После миРНК опосредованного молчание STAT6 гена, лечение IL4 должна привести к практически без увеличения CCL17 выражения. Рисунок 2. Индукция CCL17 по IL4 измеряется различными условиями количественными ПЦР в реальном времени. ) Образцы, выращенные без IL-4 была низкой, конститутивной уровень экспрессии независимо от экспрессии генов. Б) Как показано на зеленый и синий, контрольные образцы ответили нормально к лечению с IL-4, с 8-10 раз индукцию CCL17. Однако клетки трансфицированных siRNAs ориентации STAT6, как показано на красный и розовый, сократилось CCL17 выражение в ответ на ИЛ-4, поддерживая идею, что STAT6 играет важную роль в IL-4 индуцированной экспрессии CCL17.
