Wij rapporteren de ontwikkeling van een systeem voor geautomatiseerde beeldvorming en analyse van transgene zebravis embryo's in multiwell platen. Dit toont de mogelijkheid om dosisafhankelijke effecten van een klein molecuul, BCI, meten op fibroblast groeifactor reporter-gen expressie en leveren van technologie voor de oprichting van high-throughput zebravis chemische schermen.
Tonen we de toepassing van beeld-gebaseerde high-content screening (HCS) methodologie om kleine moleculen die de FGF / RAS / MAPK route kan moduleren in de zebravis embryo's te identificeren. De zebravis embryo is een ideaal systeem voor in vivo high-content chemische schermen. De 1-dag oud embryo is ongeveer 1 mm in diameter en kan gemakkelijk worden geschaard in 96-well platen, een standaard formaat voor high throughput screening. Tijdens de eerste dag van de ontwikkeling, de embryo's zijn transparant met de meeste van de belangrijkste organen aanwezig is, waardoor visualisatie van weefsel de vorming tijdens de embryogenese. De volledige automatisering van zebravis chemische schermen is nog steeds een uitdaging, maar met name in de ontwikkeling van geautomatiseerde afbeelding acquisitie en analyse. We hebben eerder geleid tot een transgene verslaggever lijn die groen fluorescerend eiwit (GFP) tot uitdrukking onder de controle van FGF activiteit en hun nut bewezen in de chemische-schermen<sup> 1</sup>. Om vast te stellen methodiek voor high throughput hele organisme screens, hebben we een systeem ontwikkeld voor automatische beeldvorming en analyse van de zebravis embryo's op 24-48 uur na de bevruchting (HPF) in 96-well platen<sup> 2</sup>. In deze video belichten we de procedures voor de arraying transgene embryo's in multiwell platen bij 24hpf en de toevoeging van een klein molecuul (BCI), dat FGF signalering hyperactivates<sup> 3</sup>. De platen worden geïncubeerd gedurende 6 uur gevolgd door de toevoeging van tricaïne om larven voorafgaand aan de automatische imaging verdoven op een Molecular Devices ImageXpress Ultra laser scanning confocale HCS lezer. De beelden worden verwerkt door Definiens Developer software met behulp van een Cognition Network Technology algoritme dat we ontwikkeld voor het detecteren en expressie van GFP te kwantificeren in de hoofden van transgene embryo's. In dit voorbeeld hebben we aandacht voor het vermogen van het algoritme om dosis-afhankelijke effecten van de BCI maatregel op de GFP-reporter-gen expressie in de behandelde embryo's.
Een belangrijke factor die de doorvoer van de zebravis chemische schermen is het gebrek aan methodiek om systematisch te verwerken 96-well platen voor beeldvorming en analyse. Omdat beelden van meercellige organismen zijn complexe, laag contrast, en heterogeen van aard, bestaande beeldanalyse algoritmen niet te detecteren en te kwantificeren specifieke structuren in het organisme. De meeste gepubliceerde zebravis chemische schermen dus mogelijk voor visueel onderzoek van de individuele putten door toegewijde personeel tijdens de gehele procedure. Dit voorkomt meestal de generatie van numerieke uitlezingen en een volledige archivering van het scherm beelden en gegevens. Bovendien, handmatige evaluatie elimineert een aantal belangrijke voordelen van het image-based screening, namelijk de mogelijkheid om retrospectieve analyses van het scherm de prestaties te voeren, om fenotypische veranderingen die niet de primaire focus van de screening campagne (bv. toxiciteit of defecten in de ontwikkeling) het onderzoeken en over te steken -referentie-screening van gegevens met het verleden of de toekomst schermen met dezelfde compound bibliotheek.
In dit rapport belichten we de methodologie voor automatische beeldvorming en analyse van de zebravis embryo's in multiwell platen zonder tussenkomst van de gebruiker. We automatische beeld vast te leggen op een ImageXpress Ultra confocale laser scanning lezer (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) om beeld Tg (dusp6: d2EGFP) PT6 embryo's in 96 wells platen en ontwikkelde een beeldanalyse algoritme gebaseerd op Cognition Definiens 'Network Technology gekwantificeerde GFP uitdrukking in de hoofden van transgene embryo's. De methode geleverd gesorteerd reacties en gekwantificeerd de in vivo activiteit van een klein molecuul activator van FGF signalering. Vergelijkbare resultaten werden verkregen met de epifluorescentie-based ArrayScan II (Cellomics Inc, Pittsburgh PA) waaruit blijkt dat het mogelijk is om geautomatiseerde beeldopname van de zebravis embryo's uitvoeren op een verscheidenheid van commercieel beschikbare plaat lezers 2. De ontwikkeling van de methodologie voor het automatisch analyseren van meercellig organisme beelden niet langer nodig voor visuele scoren door een menselijke waarnemer en in staat het genereren en archiveren van numerieke gegevens en beelden voor de retrospectieve analyse en vergelijkingen met toekomstige schermen.
Dit werk wordt gefinancierd door het NICHD / NIH (1R01HD053287) naar Hukriede, NCI / NIH (P01 CA78039) te Vogt, en NHLBI / NIH (1R01HL088016) naar Tsang.
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
Tricaine (MS222) | Sigma | Cat.# A-5040 |