Extern elektrisch veld induceert een spanning op het membraan van een cel, de zogenoemde geïnduceerde membraan spanning (ΔΦ). Door het gebruik van de potentiometrische kleurstof di-8-ANEPPS, is het mogelijk om de ΔΦ niet-invasief te meten. Deze video toont het protocol voor het meten van ΔΦ met behulp van di-8-ANEPPS.
Plaatsing van een cel in een extern elektrisch veld veroorzaakt een plaatselijke heffing herverdeling binnen en buiten de cel in de buurt van de celmembraan, wat resulteert in een spanning over het membraan. Deze spanning, de zogenoemde geïnduceerde membraan spanning (ook veroorzaakt transmembraan spanning, of geïnduceerde transmembraan potentiaal verschil) en aangeduid met ΔΦ, bestaat alleen zolang de externe veld aanwezig is. Als de rust spanning aanwezig is op het membraan, de geïnduceerde spanning superimposes (voegt) op het. Door het gebruik van een van de potentiometrische fluorescerende kleurstoffen, zoals di-8-ANEPPS, is het mogelijk om de variaties van ΔΦ op het celmembraan te observeren en om de waarde ervan niet-invasief te meten. di-8-ANEPPS wordt sterk fluorescerend wanneer gebonden aan de lipide dubbellaag van het celmembraan, met de verandering van de fluorescentie-intensiteit evenredig is met de verandering van ΔΦ. Deze video toont het protocol voor het meten van ΔΦ met behulp van di-8-ANEPPS en toont ook aan de invloed van de cel vorm op de amplitude en de ruimtelijke verdeling van ΔΦ.
Metingen van de geïnduceerde membraan (transmembraan) spanning, ΔΦ, kan belangrijk zijn in verschillende experimentele instellingen, zoals de studies van de voltage-gated kanalen membraan, actiepotentiaal voortplanting, cardiale cel stimulatie, of celmembraan elektroporatie [3, 4, 5, 6 , 7]. Met eenvoudige cel vormen, kan ΔΦ analytisch worden berekend. Bijvoorbeeld, voor een bolvormige cel, wordt ΔΦ gegeven door vergelijking van de Schwan s, waarin staat dat de spanning is evenredig met de veldsterkte en de celgrootte en volgt de cosinus functie langs het membraan [8, 9]. Voor meer ingewikkelde cellen vormen, kan ΔΦ aanzienlijk afwijken van de cosinus en moet ofwel numeriek worden bepaald met behulp van een computer [2, 10, 11], of experimenteel, met behulp van een potentiometrische kleurstof [12, 13, 14, 15].
Een van de potentiometrische kleurstoffen grote schaal gebruikt voor dit doel is di-8-ANEPPS (di-8-butyl-amino-naftyl-ethyleen-pyridinium-propyl-sulfonaat), een snelle kleurstof met excitatie en emissie spectra afhankelijk van het membraan spanning, die het mogelijk maakt niet-invasieve opmerkingen van de variaties van de ΔΦ op de celmembraan en de waarde ervan te meten. In deze video, tonen we een experimentele aanpak voor bepaling van ΔΦ door gebruik te maken di-8-ANEPPS.
De kleurstof werd ontwikkeld door professor Leslie Loew en collega's [13, 14] aan de Universiteit van Connecticut en behoort tot de klasse van de snelle respons kleurstoffen. di-8-ANEPPS is nonfluorescent in het water en wordt sterk fluorescerende wanneer het wordt opgenomen in de lipide dubbellaag van de celmembraan. Een verandering in ΔΦ resulteert in een verandering van de intramoleculaire ladingsverdeling en de bijbehorende veranderingen in de spectrale profiel en de intensiteit van de fluorescentie van de kleurstof's. De fluorescentie-intensiteit van di-8-ANEPPS varieert in verhouding tot de verandering van ΔΦ, de reactie van de kleurstof is lineair voor spanningen, variërend van -280 mV tot +250 mV [4, 16]. Relatief kleine veranderingen in fluorescentie van de kleurstof, ongelijke membraankleuring, en kleurstof internalisatie maken di-8-ANEPPS minder geschikt voor de absolute metingen van membraan spanning, bijvoorbeeld de rust component, maar deze pogingen werden ook gemeld [17]. Het is echter geschikt voor het meten van grotere veranderingen in de membraan spanning, zoals het begin van geïnduceerde membraan spanning in nonexcitable cellen blootgesteld aan externe elektrische velden [12, 13], of actiepotentialen in prikkelbare cellen [4, 5]. Hoewel het hier niet toegepast, di-8-ANEPPS maakt het ook mogelijk de bepaling van de ΔΦ door ratiometrische metingen van de fluorescentie excitatie [18] of emissie [19], die verhoogt de gevoeligheid van de reactie en vermindert de bovengenoemde effecten. Als di-8-ANEPPS vlekken het membraan, het kan ook duidelijk worden gebruikt als een membraan marker [2].
Een van de nadelen van de kleurstof is dat het gevoelig is voor photobleaching, zodat dat langdurige blootstelling aan het sterke licht moeten worden vermeden. Kalibratie van de kleurstof wordt uitgevoerd met ofwel (i) kalium ionofoor valinomycin en een set van verschillende kalium concentraties in externe medium [2,18], of (ii) patch-clamp in spanning klem mode [17].
Ten slotte is met de metingen van ΔΦ op de sferische cellen en cellen van meer complexe vormen, de video toont de invloed van de cel vorm op de amplitude en de ruimtelijke verdeling van ΔΦ. Dus voor bolvormige cellen ΔΦ is dicht bij een cosinus, in overeenstemming met vergelijking Schwan's, terwijl voor de meer gecompliceerde cellen vormen de ruimtelijke verdeling van ΔΦ is ingewikkelder [20] …
Dit werk werd ondersteund door de Sloveense Research Agency met project-Z2 9.229 en programma P2-0249. Deze video staat voor het aanvullende materiaal voor de "Elektroporatie-based technologieën en behandelingen 'wetenschappelijke workshop en de postdoctorale opleiding, tweejaarlijks georganiseerd door de faculteit Elektrotechniek aan de Universiteit van Ljubljana, Slovenië.
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
di-8-ANEPPS | Invitrogen | D-3167 | potentiometric fluorescent dye | |
pluronic | Invitrogen | P3000MP | potassium ionophore | |
DMSO | Sigma-Aldrich | D2650 | ||
SMEM | Sigma-Aldrich | M8167 or M4767 | Spinner modification of the Minimum Essential Medium | |
Ham-F12 | Sigma-Aldrich | N4888 | culture medium | |
fetal calf serum | Sigma-Aldrich | F4135 | ||
L-glutamine | Sigma-Aldrich | G7513 | ||
crystacillin | Pliva | 625110 | antibiotic | |
gentamicin | Sigma-Aldrich | G1397 | antibiotic | |
Lab-Tek II | Nalge Nunc | 155379 | chamber | |
DC voltage supply | Elektro-Automatik | |||
microprocessor-controlled switcher | Custom made | |||
electrodes | Custom made | Pt/Ir |