Антитела профилирования по люциферазы Системы Иммунопреципитация (LIP)

1. Схема Обзор: Это видео демонстрирует этапы выполнения LIPS анализа. Антигены выражаются в Cos1 клеток рекомбинантных люциферазы Renilla (ККО)-антиген слияний и сырой экстрактов, полученных и использованных без очистки. LIPS анализ проводится по инициативе инкубации падла электронной Ruc-антиген экстрактов с пациентом сывороток в лунки. Антитело-антиген смесь затем переведен в 96-луночного фильтр пластины, содержащей белок / G бисером, чтобы захватить IgG молекулы. После мытья фильтра пластины, содержащей белок / G бусы, антитела связаны Ruc-антиген измеряется добавлением субстрата coelenterazine и световых единицах измеряют люминометра. ЧАСТЬ 1: Трансфекция плазмиды для производства Renilla-антиген Белки Fusion Настройка: Cos1 клетки культивируют в DMEM-10% FCS с помощью стандартных протоколов культуры ткани. Плазмиды для Renilla люциферазы слияния были описаны ранее 1. ДНК этих плазмид которая подготовлена ​​с применением комплекта Midiprep от Qiagen. Выход должен быть примерно 1 -3 мг. Измерить концентрацию ДНК и хранить 1000 мкг / мл раствора акции при температуре -20 ° C. Порядок действий: За день до трансфекции, сплит COS-1 клеток в новую 100 х 20 мм блюда примерно 2 х 10 6 на чашку и инкубировать при температуре 37 ° C. На следующий день, COS-1 клетках должна быть 80-95% вырожденная. Этикетка 1,5 мл полипропиленовые трубы микроцентрифужную для каждой плазмидной ДНК для трансфекции. Разрешить FuGENE-6 трансфекции реагента, который хранится при температуре 4 ° С, чтобы нагреть до комнатной температуры. Добавить 94 мкл Opti-MEM СМИ, чтобы каждый микроцентрифужную трубки. Затем добавьте 6 мкл FuGENE 6 до Opti-MEM средств массовой информации, не прикасаясь к боковой стенке. Выдержите смесь в течение 5 минут при комнатной температуре. Добавьте 1-2 мкг (со склада ДНК 1mg/ml) плазмиды для Renilla люциферазы слияние антиген конструкции. Смешать и инкубировать затем смесь в течение 15 минут при комнатной температуре. Передача ДНК-FuGENE 6-Opti-MEM решение клеток капала его равномерно в СМИ Cos1 клеток. ЧАСТЬ 2: Уборочная Renilla-антиген Слияния Через два дня после трансфекции, Cos-1 клетки собирают. Это инициировано удаление средств массовой информации и последующей промывкой клеток с 6 мл PBS. После декантации PBS, пипетки от любой остаточной PBS от блюдо культуры ткани. Добавить 1,4 мл холодного буфера для лизиса состоит из 50 мМ Трис, рН 7,5, 100 мМ NaCl, 5 мМ MgCl 2, 1% Тритон Х-100, 50% глицерина и ингибиторы протеазы (2 таблетки полных коктейль ингибиторов miniprotease на 50 мл лизис буфера). Урожай клетки с клеткой забияка и быстро передавать половине лизат к каждому из двух пробирки на 1,5 мл микроцентрифужную на льду. Брэнсон Sonifier 150 используется для разрушить открытые клетки. Место микроцентрифужных пробирку Клеточный лизат на льду и пульс в течение 5 сек, 5 сек и 5 сек с ультразвуком настройки 2, 2 и 4, соответственно. Центрифуга Клеточный лизат при 12500 оборотов в течение двух 4 минуты спинов при 4 ° C. После первого спина, аккуратно переверните труб для удаления свободно прилагается мусора с боковой стенке трубы. После повторного запуска, тщательно передачи супернатант, не нарушая гранулы, из двух труб в новую пробирку микроцентрифужную на льду. Рассчитать световых единицах (LU) за мкл лизата. Для измерения LU, развести 1 мкл лизата с 8 мкл PBS в новую пробирку и отцентрифугировать. Непосредственно добавить 100 мкл 1X coelenterazine субстрата смесь разбавляется и сразу же мерой свечения в трубке использованием трубки люминометра (20/20 н Тернер Scientific) с 5-секундным читать. Магазин Ruc-антиген лизат при температуре -20 ° С в течение 1-2 дней или хранить в течение длительного периода раз в аликвоты при -80 ° C. ЧАСТЬ 3: Подготовка пластины Сера Мастер Сделать пластины сыворотки мастер, добавьте сначала 450 мкл буфера (50 мМ Трис, рН 7,5, 100 мМ NaCl, 5 мМ MgCl 2, 1% Тритон Х-100) в каждую лунку 96-артезианской планшет полипропилена . На данном этапе, красителей, фенола красного, также могут быть включены в буфере (конечная концентрация составляет 0,2 мкг / мл в буфере), чтобы действовать в качестве индикатора для мониторинга будущих образцов сыворотки сложение и другие этапы анализа губы. Затем добавьте 50 мкл сыворотки от каждого образца для различных скважин содержащие 450 мкл буфера А. Заметим, что это 1:10 разведения сывороток в буфере А. Обычно сыворотки не добавляется в последних двух скважин мастера пластины, поскольку это зарезервировано для буфера пробелами. Перед тем как использовать мастер пластину, она широко потрясен (1-2 часов) по ротатор платформы. Сыворотки в мастер пластины устойчивоответственные за не менее 1 месяца (или больше) при 4 ° С, при хранении правильно, чтобы предотвратить испарение. Как описано ниже, то эта табличка мастер обеспечивает 10 мкл разведенной сыворотки, чтобы быть повторно снять для профилирования сыворотки против нескольких антигенов. Большие и меньшие пластины мастер может также использоваться. Печать пластины хорошо с парафильмом, когда он не используется. ЧАСТЬ 4: губы анализа Полипропилен 96-мелкой луночный микропланшет используются для тестирования сывороток. На первом этапе, добавить 40 мкл буфера в каждую лунку 96-луночного планшета использованием 8-канальный микропипетки. Затем возьмите 10 мкл разведенной сыворотки (1 мкл сыворотки эквивалент) с мастером тарелку и добавить его прямо в каждую лунку рабочей пластины с использованием 8-канальный микропипетки. Мастер смесь, содержащая Ruc-антиген экстракта следующего сформулированы так, что 1 X 10 7 световых единицах (LU) добавляется в 50 мкл буфера в каждую лунку. Нижние входы (всего 1 X 10 6) также может быть использован, но приведет к снижению динамического диапазона. Сделать эту смесь мастер и пипеткой 50 мкл Ruc-антиген смеси в каждую лунку. Инкубируйте планшет на роторном шейкере в течение 1 часа при комнатной температуре. Во время инкубации, добавляют 5 мкл 30% суспензии Ultralink белка / G шариков (Пирс биотехнологии, Рокфорд, штат Иллинойс) в PBS на дно каждой лунки новой 96-фильтра HTS пластины (Millipore, Bedford, MA) . После 1 часа инкубации, передачи 100 мкл Ruc антиген-антитело реакционной смеси до 96 и фильтром HTS чашки, содержащие белок / G бисером использованием 8-канальный микропипетки. Инкубируйте 96-луночного фильтра пластина на ротационном шейкере в течение 1 дополнительный час при комнатной температуре. Следующая промывки фильтра пластина на вакуумный коллектор. Каждая скважина промывается в 8 раз с 100 мкл буфера, а затем два раза по 100 мкл PBS. Это можно сделать вручную или с помощью роботов станции пипетки. После последней стирки, вакуум отключается. Снимите фильтр пластины и промокните насухо с помощью стека бумажных полотенец или фильтровальную бумагу убедившись, что для удаления влаги на верхней и нижней части пластины. ЧАСТЬ 5: Измерение люминесценции и анализ данных Настройка: Л. Б. Бертольд 960 Centro микропланшет люминометра используется для определения люминесценции в каждую лунку с помощью одной форсунки. Как только машина включена, промыть инжектор дистиллированной H 2 O использованием цикла инжектор мыть. Coelenterazine субстрат подготовлен с использованием подложки Promega Renilla комплект, как описано производителем. Как правило 6 мл 1X смесь субстрата coelenterazine (т.е. 60 мкл фондовом coelenterazine плюс 6 мл 1X буфера) получают для грунтования машину и работает на один полный 96-луночного планшета. Прежде чем анализировать пластины, Л. Б. Бертольд 960 Centro микропланшет люминометра грунтуется с 1X coelenterazine подложки. Открытые программы файл, содержащий настройки для потребителей инъекционных подложки и чтения пластины. Для этих измерений, 50 мкл coelenterazine субстрат вводят внутривенно, пластины встряхивают в течение 2 секунд, затем 5 секунд прочитать люминесценции. Хотя пластинка люминометра имеет возможность прочитать всю пластинку, частичное читать пластины также могут быть выбраны (под чтение меню). Запустите программу, которая инициирует чтение пластины. После запуска, снимите планшет фильтр быстро, чтобы предотвратить утечку люминометра. Экспорт данных, полученных с программой MikroWin в формате Excel для анализа. Мы рекомендуем оценки сыворотки от двух независимых работает. Данные усреднены для получения значений LU титр для каждого образца. Эти значения могут быть скорректированы дальнейшие вычесть буфера пробелами. Дополнительный анализ данных, таких как определение отсечки может быть рассчитана путем вычитания из средней плюс 3 или 5 стандартных отклонений от контрольных значений.