Fare Periton Boşluk Hücreleri İzolasyon
Summary
Periton boşluğuna memelilerde doğuştan gelen bağışıklık yanıtları için çok önemli olan farklı bağışıklık hücre popülasyonlarının içerir. Verimli bir izolasyon yöntemi, bu hücrelerin biyokimyasal ve fonksiyonel analizler için gereklidir. Burada fare periton boşluğuna hücrelerin izolasyonu için kapsamlı bir yöntem sağlar.
Abstract
Periton boşluğuna memelilerin karaciğer, dalak, mide-bağırsak ve diğer iç organları içeren bir membran-bağlı ve karın boşluğunda sıvı dolu. Bu bağışıklık hücreleri, makrofajlar, B hücreleri ve T hücreleri de dahil olmak üzere bir dizi barındırıyor. Periton boşluğunda naif makrofajlar yüksek sayıda varlığı naif doku ikamet eden makrofaj (1) toplanması için tercih edilen bir site yapar. Peritoneal kavite varlığı nedeniyle geleneksel B2 hücrelerine ek olarak B1 hücreler olarak bilinen eşsiz bir periton boşluğuna yerleşik B hücre alt B hücreleri çalışma için önemlidir. B1 hücreleri CD11b ve CD5 yüzey ifadesi ile ayırt edilebilir B1a ve B1b hücreleri, bölünmüştür. B1 hücreleri çeşitli patojenler (2-4) bir erken koruma sağlayan doğal IgM önemli bir kaynak. Bu hücreler, Doğa (5) otoreaktif, ama onlar otoimmünite önlemek için nasıl kontrol edilir hala tam olarak anlaşılmış değildir. Aksine, CD5<sup> +</sup> B1a hücreleri IL-10 üretim kapasitesi (6) sayesinde bazı düzenleyici özelliklere sahip. Bu nedenle, periton boşluğuna B1 hücreleri çünkü farklı fonksiyon ve onların gelişmesi ve düzenlenmesi ile ilgili birçok adressiz sorular çalışma ilginç bir hücre popülasyonu. Periton boşluğuna ikamet eden bağışıklık hücrelerinin izolasyon peritoneal kavite içinde tanımlanmış bir yapı eksikliği nedeniyle zordur. Bizim protokolü sonra flow sitometri ve farklı biyokimyasal ve immünolojik testleri için fenotipik analizi için kullanılabilir farelerin periton boşluğu, canlı bağışıklık hücreleri elde etmek için bir prosedür anlatacağız.
Protocol
Discussion
Periton boşluğuna hücrelerinin izolasyonu, farklı bağışıklık hücreleri, başta makrofajlar ve spesifik B hücre alt çalışma için önemli bir tekniktir. Bu basit bir süreç olmasına rağmen, bazı kritik adımlar vardır. Saf bir periton boşluğuna hücre popülasyonu elde etmek için toplanan örnek kan kirlenmesine varlığı kaçınılmalıdır. Servikal dislokasyon tarafından Ötenazi periton boşluğunda kan kirlenmesini önlemek için dikkatli bir şekilde yapılmalıdır. Alternatif olarak CO 2 kullanılabilir. Buna ek olarak, prosedüre uygun bakım sırasında peritoneal kavite, mesane ya da herhangi bir diğer organlara delinmesiyle önlemek için alınmalıdır. Enjekte edilen sıvı en kurtarma, hücre verimi önemlidir.
Bu prosedürü, yaygın olarak orta numaraları bu yana ikamet eden makrofaj biyoloji okumak için kullanılır, unstimulated makrofajlar kolayca makrofaj koloni stimüle edici faktör (8 kullanılarak, in vitro olgun makrofajlara miyeloid progenitör hücrelerin ayırt zahmetli görev aksine, periton boşluğuna elde edilebilir , 9). Tiyoglikolat kullanımı makrofajlar (7) fizyolojik özelliklerini değiştirebilir olsa da periton boşluğunda makrofaj verim, tiyoglikolat ortaya çıkarma yöntemi kullanarak geliştirilebilir.
B hücreleri bağışıklık sisteminin doğal ve adaptif bağışıklık hem de önemli rol oynayan önemli bir parçasıdır. Farklı B hücre alt arasında, B1 hücreleri B hücreleri doğuştan gelen bağışıklık, otoimmünite ve bağışıklık düzenleme yer eşsiz bir alt oluşmaktadır. B1 hücreler öncelikle periton boşluğunda bulunan ve kendini yeniler. Onlar, ilk satırı, bir virüs sayısı ve bakteriler (10-12) karşı koruma sağlar doğal IgM birincil üreticiler biri. B1 hücreler de immün regülasyon yer alan önemli bir sitokin olan IL-10 (6), önemli bir kaynağıdır. B1 hücreleri ile çeşitli çalışmalar takip olmasına rağmen, hala özel, kendi karşıt fonksiyonları daha fazla değerlendirme için düzenleyici rol kapsamı vardır. Periton boşluğuna hücre izolasyon yöntemi B1 hücrelerinin fonksiyonlarını incelemek için eşsiz bir fırsat sunuyor.
Acknowledgements
Bu çalışma NIH hibe AI069358 ve BloodCenter Araştırma Vakfı tarafından kısmen desteklenmiştir.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Thioglycollate Medium, Brewer Modified | BD BBL | 211716 |
References
- Zhang, X., Goncalves, R., Mosser, D. M. The isolation and characterization of murine macrophages. Current Protocols in Immunology. , (2008).
- Boes, M., Prodeus, A. P., Schmidt, T., Carroll, M. C., Chen, J. A critical role of natural immunoglobulin M in immediate defense against systemic bacterial infection. J. Exp. Med. 188, 2381-2386 (1998).
- Mc Daniel, L. S., Benjamin, W. H., Forman, C., Briles, D. E. Blood clearance by anti-phosphocholine antibodies as a mechanism of protection in experimental pneumococcal bacteremia. J. Immunol. 133, 3308-3312 (1984).
- Paciorkowski, N., Porte, P., Shultz, L. D., Rajan, T. V. B1 B lymphocytes play a critical role in host protection against lymphatic filarial parasites. J. Exp. Med. 191, 731-736 (2000).
- Mercolino, T. J., Arnold, L. W., Hawkins, L. A., Haughton, G. Normal mouse peritoneum contains a large population of Ly-1+ (CD5) B cells that recognize phosphatidyl choline: relationship to cells that secrete hemolytic antibody specific for autologous erythrocytes. J. Exp. Med. 168, 687-698 (1988).
- O’Garra, A., Chang, R., Go, N., Hastings, R., Haughton, G., Howard, M. Ly-1 B (B-1) cells are the main source of B cell derived interleukin 10. Eur. J. Immunol. 22, 711-717 (1992).
- Hoover, D. L., Nacy, C. A. Macrophage activation to kill Leishmania tropica: Defective intracellular killing of amastigotes by macrophages elicited with sterile inflammatory agents. J. Immunol. 132, 1487-1491 (1984).
- Austin, P. E., McCulloch, E. A., Till, J. E. Characterization of the factor in L-cell conditioned medium capable of stimulating colony formation by mouse marrow cells in culture. J. Cell Physiol. 77, 121-134 (1971).
- Stanley, E. R. The macrophage colony-stimulating factor, CSF-1. Methods Enzymol. 116, 564-587 (1985).
- Baumgarth, N., Chen, J., Herman, O. C., Jager, G. C., Herzenberg, L. A. The role of B-1 and B-2 cells in immune protection from influenza virus infection. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 252, 163-169 (2000).
- Baumgarth, N., Herman, O. C., Jager, G. C., Brown, L. E., Herzenberg, L. A., Chen, J. B-1 and B-2 cell-derived immunoglobulin M antibodies are nonredundant components of the protective response to influenza virus infection. J. Exp. Med. 192, 271-280 (2000).
- Berland, R., Wortis, H. H. Origins and functions of B-1 cells with notes on the role of CD5. Annu. Rev. Immunol. 20, 253-300 (2002).
