Co-cultura 3D com interação direta: co-cultivar células cancerígenas com monócitos para estudar sua interação

Para começar, adicione o colágeno DQ IV, um substrato de proteína de corante fluorescente em um extrato de matriz extracelular ou ECME. Despeje este extrato em cada poço de um slide de dois poços. Rotular o primeiro, bem como a co-cultura, segundo como controle. Adicione uma quantidade apropriada de suspensão celular cancerígena fluorescentemente rotulada em poços, e incubar o slide a 37 graus Celsius para o tempo desejado para promover o apego celular.

Adicione uma quantidade necessária de suspensão celular monócitos ao primeiro poço. Deixe o ECME solidificar a 37 graus Celsius. Despeje proporções iguais de mídia de cultura de células cancerosas e monócitos em cada poço e incubar o slide a 37 graus Celsius para a duração desejada em um ambiente de dióxido de carbono. No poço da co-cultura, as células cancerígenas secretam proteínas como monócitos de proteína quimiofos para atrair monócitos.

Em contraste, os monócitos produzem metaloproteinase matricial ou MMP, para degradar o colágeno, promovendo a invasão de células cancerígenas. Observe o slide sob um microscópio confocal. A degradação do colágeno DQ emite fluorescência que pode ser mais vista nas células de co-cultura indicando interação celular, enquanto menos em células de controle. No protocolo a seguir, vamos co-cultivar células cancerígenas de mama com monócitos para estudar sua interação.

Para rotular células BRC e monócitos com coumarin e rhodamina comercialmente disponíveis antes da cultura celular, prepare uma monocamada de duas vezes 10 para as seis células BRC de interesse e substitua o meio padrão por solução de trabalho pré-armada suficiente do corante fluorescente. Incubar as células a 37 graus Celsius em um ambiente umidificado de 5% de dióxido de carbono por 30 minutos. Em seguida, aspire a solução de corante e use 1x PBS suficiente para enxaguar suavemente as células.

Aspire o PBS e adicione o meio padrão. Para tentarpsinizar as células adicionam dois mililitros de trippsina de 0,05% e 0,48 miliamilitro EDTA ao frasco, e incubam as células a 37 graus Celsius por 5 a 10 minutos. Adicione 200 microliters de FBS para parar a trippsinização e sete mililitros do meio correspondente sem suplementos.

Resuspend as células por pipetação, em seguida, transferir 10 microliters das células para uma câmara de Neubauer e contá-las. Em seguida, pelota as células a 430 x g à temperatura ambiente por cinco minutos, em seguida, descartar o sobrenante e usar mililitros de corante fluorescente pré-w armado solução de trabalho para suspender as células.

Incubar a suspensão das células a 37 graus Celsius em um ambiente umidificado de 5% de dióxido de carbono por 30 minutos. Depois de emarar as células novamente, descarte a solução de trabalho de corante e use 5 a 7 mililitros de 1x PBS para resuspencar suavemente as células. Em seguida, depois de pelotização das células mais uma vez e descartar o PBS, resuspended as células em 5 a 7 mililitros de médio padrão.

Conte 10 microliters da suspensão celular. Configure uma co-cultura espalhando ECME suficiente na parte inferior do poço para formar uma camada uniforme em cada poço de um sistema de slides de câmara de quatro poços. Placa 20 microliters de uma única suspensão celular contendo 5 vezes 10 para a quinta células BRC rotuladas por poço. Após 15 a 20 minutos a 37 graus Celsius, adicione uma suspensão de 2,5 vezes 10 aos cinco monócitos rotulados em 80 microliters de médio ensaio, complementados com 60% de ECME.

Permita que o ECME solidifique um Celsius de 37 graus por 15 a 20 minutos. Agora, adicione 1 mililitro de uma mistura de 1:1 das células BRC e meio de cultura monocito. Incubar as coculturas a 37 graus Celsius em um ambiente umidificado de 5% de dióxido de carbono durante 24 horas, 48 horas ou cinco dias para acompanhar as mudanças em diferentes pontos de tempo.

Para degradar as proteínas ECM e recuperar as células das culturas, aspirar e descartar o meio, em seguida, adicionar 0,5 mililitros de 1x PBS com 0,1% de trippsina e 0,25% EDTA à cultura. Incubar as células a 37 graus Celsius por três horas. Após a incubação, adicione 0,5 mililitros de 1x PBS com 10% de FBS para neutralizar a trippsina e resuspenque as células, tubos vigorosamente para obter uma única suspensão celular.

Após a dotização das células, descarte o supernascido e resuspende as células em cinco mililitros de 1x PBS com 10% de FBS. Repita o passo uma vez. Sujeitar a suspensão da célula ao FACS com o instrumento apropriado. Certifique-se de que as populações finais são pelo menos 95% puras.