Encyclopedia of Experiments: Cancer Research
É necessário ter uma assinatura JoVE para assistir este Faça login ou comece sua avaliação gratuita.
Transcript
Please note that all translations are automatically generated.
Lentivirus är ett retrovirus som innehåller RNA-genetiskt material. Detta virus ger en effektiv och stabil metod för att introducera transgener till cancercelllinjer. Börja med att tillsätta neuraminidas till ett rör som innehåller Lentivirus som uttrycker grönt fluorescerande protein, eller GFP. Håll röret på 37 grader Celsius i en timme för att öka virusets bindningseffektivitet.
Därefter centrifug ett rör som innehåller tumörcellsupphängning för att bilda en pellet. Tillsätt mammosfärmedier som innehåller polybren för att återanvända cellerna. Polybren är en katjonpolymer som ökar Lentiviral infektionseffektivitet. Plätera nu det optimala antalet tumörceller per brunn i en sex brunns vävnadskulturplatta. Tillsätt den önskade mängden Lentivirus i varje brunn på odlingsplattan.
Snurra plattan för att blanda innehållet och håll dig på 37 grader Celsius i 96 timmar med kontinuerlig tillförsel av koldioxid. Lentiviruset kommer in i cellen och släpper ut RNA. Den virala omvända transkriptasen omvandlar RNA till dubbelsträngat DNA som integreras i värdgenomet. Placera plattan under ett fluorescerande mikroskop och övervaka celler för framgångsrik transduktion. De transduced cellerna fluoresce på grund av att GFP uttryck.
I exempelprotokollet kommer vi att utföra transduktion av PDX-dissocierade tumörceller med Lentiviral vektorer.
För att omvandla tumörcellerna, centrifugera de isolerade cellerna för återsuspension i två milliliter mammosfärmedel. Efter räkning, centrifugera cellerna igen och återanvänd pelleten i två milliliter mammosfärmedium, kompletterat med 20 mikroliter polybren. Därefter, platta 2 gånger 10 till den femte livskraftiga tumör cellerna per brunn i en ultra låg vidhäftning sex brunn vävnad kulturplatta och Lentiviral partiklar till cellerna vid en multiplicity av infektion av 10.
Snurra plattan för att blanda viruset med cellerna och inkubera samkulturerna vid 37 grader Celsius och 5% koldioxid i upp till 96 timmar, tillsätt 500 mikroliter färskt mammosfärmedium efter de första 24 timmarna. När minst 10% av cellerna är GFP-positiva, överför de transduced cellerna från minst en brunn till ett 15 milliliter koniskt rör på is och tvätta brunnen med en milliliter mammosfärmedium.
Poola tvätten med cellerna och centrifugera tumörcellerna i 10 milliliter HBSS plus HEPES. Slutligen återanvänd cellerna i 50 mikroliter källarmatrisextrakt på is och ladda de inbäddade cellerna i en 0,5 milliliter insulinspruta för reimplantation.
