Мы опишем способ получения ДНК пулями золота и продемонстрировать использование таких пуль biolistically трансфекции нейронов гиппокампа в культуре ломтиками.
Biolistic трансфекции это физические средства трансфекции клеток бомбардирующих ткани с высокой скоростью ДНК частицы, покрытые. Мы предоставляем подробные протокол для biolistic трансфекции срезах гиппокампа крыс, от первоначальной подготовке ДНК пулями в финал съемки органотипической культур ломтик использованием генной пушки. Трансфекции генов пушка является эффективным и простым средством трансфекции нейронов и особенно полезен для флуоресцентной маркировки небольшая часть клеток в тканях кусочек. В этом видео, мы первые наброски шагов, необходимых, чтобы покрыть частицы золота с ДНК. Далее показано, как линия внутри пластиковой трубкой с золотом / ДНК пули, и как разрубить этот трубопровод для получения пластиковых картриджей для загрузки в генной пушки. Наконец, мы выполняем biolistic трансфекции гиппокампа крыс культур срез, демонстрирующий обработку Bio-Rad Гелиос генной пушки и предложение консультаций устранения неисправностей для получения здоровых и оптимально трансфицированных ломтиками ткани.
Biolistic трансфекции это физические средства трансфекции клеток с помощью бомбардировки живой ткани с высокой скоростью ДНК частицы, покрытые золотом. В частиц опосредованного переноса генов, в общем-трансфицированных клеток результат, когда пуля приходит в состояние покоя в ядре. Хотя много различных методов трансфекции существуют, например, микроинъекции, липофекция, кальций-фосфат трансфекции, электропорации и вирусной трансфекции, biolistic трансфекции может предложить менее трудоемким и эффективной альтернативой для трансфекции клеток, которые не так легко трансфекции с помощью других методов. На самом деле, он был впервые разработан в качестве методики переноса генов в растениях так как наличие клеточной стенки сделаны трансфекции трудно использованием существующего метода 1. Точно так же biolistics приобрел популярность в области нейробиологии с пост-митотического нейронов, которые заведомо трудно трансфекции 2,3. В частности, она широко известна как принцип техники, которые будут использоваться в экспериментах, направленных на оценку тонкой морфологии отдельных нейронов в интактных ломтики мозга. Методы, описанные здесь, обеспечивают детальное и всестороннее объяснение, как выполнить biolistic трансфекции культурный ломтики мозга с помощью ручных генной пушки (Helios генной пушки системы; Bio-Rad).
Biolistic трансфекции стала предпочтительным методом трансфекции нейронов в срез культуры, поскольку она позволяет трансфекции редкими количество клеток по всему мозгу срез. Таким образом, отдельные нейроны могут рассматриваться в изоляции. Так как этот метод особенно хорошо подходит для трансфекции нейронов в мозге ломтик, он часто используется в сочетании с 2-фотонной микроскопии, так как 2-фотонного возбуждения позволяет визуализацию флуоресцентно меченых клеток глубоко внутри ткани рассеяния света 4. Действительно изображения с высоким увеличением одного пирамидных нейронов, представленные в этом видео были получены с помощью пользовательских построен 2-фотона лазерного сканирующего микроскопа. В заключение biolistic трансфекции является эффективным средством трансфекции отдельных клеток в контексте высокой плотностью окружающих клеток, и как таковое оказалось чрезвычайно полезным для флуоресцентной маркировки отдельных нейронов в нейронной культуры срез.
Мы хотели бы поблагодарить Марка Lucanic и Хуай-Чен Ченг за помощь в приобретении изображений с низким увеличением целых срезах гиппокампа, представленные в этом видео. Мы также хотели бы поблагодарить Сара Пэриш за помощь с текстом сопровождающие видео.
Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
1.6um gold particles (microcarrier) | 0.25g | Bio-Rad | 1652264 | |
1M CaCl2 | Fluka | 21115 | ||
100% EtOH | 1pint | Gold shield | ||
Cartridge Tubing | Bio-Rad | 1652412 | ||
Scintillation vials | 20ml, 500/case | VWR | 66021-668 | |
Dessication pellets | “Dricap” | MTI (800-445-9890) | ||
Water bath sonicator | model 50T | VWR | ||
Cartridge holder | pack of 5 | Bio-Rad | 1652426 | |
Barrel liner | pack of 5 | Bio-Rad | 1652417 | |
Diffuser screen | pack of 5 | Bio-Rad | 1652475 | |
O-ring | 75 Viton, Size 007, Qty, 100 | McMaster-Carr | ||
Screen (mesh) | McMaster-Carr | 144258 | ||
PVP | 20mg/ml in EtOH | Bio-Rad | Comes with tubing from biorad | |
Tubing prep station | Bio-Rad | 1652418 | ||
Tubing cutter | Bio-Rad | 1652422 | ||
Helios Gene-Gun | Bio-Rad | 1652411 | ||
Gene gun hose | Bio-Rad | Comes with Gene-Gun | ||
Spermidine | 5g | Sigma | s-0266 |