塩基記録:ショウジョウバエの味覚ニューロン応答解析技術
Summary
電気生理学的記録のめったに使用されない方法である塩基記録は、従来の記録方法では調べることができなかった味覚コーディングの特徴を分析することができます。塩基記録により、従来の電気生理学的手法では研究できない疎水性刺激に対する味覚応答の分析も可能になります。
Abstract
昆虫は、先端に毛穴がある味毛(センシラ)を通して外界を味わっています。センシラムが潜在的な食料源と接触すると、食物源からの化合物が細孔から入り、内部のニューロンを活性化します。50年以上にわたり、これらの応答はチップ記録と呼ばれる技術を使用して記録されてきました。しかし、この方法には、刺激接触の前後に神経活動を測定できないことや、味覚が水溶液に溶ける必要があることなど、大きな制限があります。ここでは、これらの制限を克服するベースレコーディングと呼ばれる手法について説明します。塩基記録により、刺激前、刺激中、刺激後の味覚ニューロンの活動を測定できます。したがって、味覚刺激後に発生するOFF応答の広範な分析が可能になります。水への溶解度が非常に低い長鎖フェロモンなどの疎水性化合物の研究に使用できます。要約すると、塩基記録は、ニューロン活動を測定する手段として単一感覚電気生理学の利点を提供し、遺伝的ツールを必要とせずに高い空間的および時間的分解能を提供し、従来の先端記録技術の主要な制限を克服します。
Introduction
ショウジョウバエを含む昆虫は、周囲から複雑な化学情報を抽出できる洗練された味覚システムに恵まれています。このシステムにより、さまざまな物質の化学組成を識別し、栄養価の高い物質と有害な物質を区別することができます1,2。
このシステムの中核となるのは、味毛またはセンシラと呼ばれる特殊な構造であり、体のさまざまな部分に戦略的に配置されています。ショウジョウバエでは、これらのセンシラは、ハエの頭1,2,3,4の主要な味覚器官であるラベルと、脚と翼1,2,5,6にあります。ラベルは吻の先端に位置し、2つの葉4,7,8を含みます。各葉は、短、長、中間に分類される31の味覚感覚で覆われています4,7,8。これらのセンシラは、それぞれ2〜4個の味覚ニューロン1,2,9,10を収容します。これらの味覚ニューロンは、少なくとも4つの異なる遺伝子ファミリー、すなわち味覚受容体(Gr)、イオン栄養受容体(Ir)、スリ(Ppk)、および一過性受容体電位(Trp)遺伝子1,2,11,12,13のメンバーを発現します.この受容体とチャネルの多様性により、昆虫は、不揮発性と揮発性の両方の手がかりを含む幅広い化合物を認識する能力を備えています1,2,14。
50年以上にわたり、科学者たちは、チップレコーディングと呼ばれる技術を使用して、味覚ニューロンとその受容体の応答を定量化してきました3,4,6,8,13,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24 、25、26、27、28、
29、30、31、32、33、34、35。ただし、この方法には大きな制限があります。第一に、神経活動は刺激との接触中にのみ測定することができ、接触の前後には測定できない。この制限により、自発的なスパイク活動の測定が不可能になり、OFF応答の測定が妨げられます。第二に、水溶液に溶ける味覚のみをテストできます。
これらの制限は、「塩基記録」と呼ばれるめったに使用されない代替電気生理学的手法によって克服できます。ここでは、Marion-Pollら24が使用した方法から採用したこの手法について説明し、14を便利に測定できるようになった重要な味覚コーディング機能を示します。
Protocol
以下のプロトコルは、イェール大学のすべての動物飼育ガイドラインに準拠しています。 1.ハエ 10〜15匹の新しく出現したフライを、25°Cおよび60%の相対湿度で、12:12時間の明暗サイクルで新鮮な標準培養バイアルに入れます。 生後3〜7日でハエを使用してください。 2. 化学感覚刺激 利用可能な最?…
Representative Results
図4Aは、感覚から生じる自発的なスパイクを示しています。それらは振幅に基づいて2つのクラスに分類され、大きなスパイクは苦味化合物に敏感なニューロンに由来し、小さなスパイクは糖に反応するニューロンに由来します。スパイク振幅と機能特異性の関係は、遺伝子実験によって裏付けられています4,14,37,38,39。</sup…
Discussion
ある種のセンシラからの記録では、異なるニューロンのスパイクを区別することが困難な場合がある。例えば、S感知器とI感知器の糖ニューロンと機械感覚ニューロンは、同様の振幅のスパイクを生成し、それらを区別することを困難にする4,14。非常に鋭いタングステン記録電極を使用すると、記録電極の賢明な配置と同様に、機械感覚ニューロ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
サポートしてくれたZina Berman、原稿にコメントしてくれたLisa Baik、そして議論をしてくれたCarlson研究室の他のメンバーに感謝します。この研究は、H.K.M.D.へのNIH助成金K01 DC020145を支援しました。NIHはR01 DC02174、R01 DC04729、およびR01 DC011697をJ.R.C.に付与します。
Materials
| Microscope | Olympus | BX51WI | equipped with a 50X objective (LMPLFLN 50X, Olympus) and 10X eyepieces. |
| Antivibration Table | TMC | 63-7590E | |
| motorized Micromanipulators | Harvard Apparatus and Märzhäuser Micromanipulators | Micromanipulator PM 10 Piezo Micromanipulator | |
| manual Micromanipulators | Märzhäuser Micromanipulators | MM33 Micromanipulator | |
| Magnetic stands | ENCO | Model #625-0930 | |
| Reference and recording Electrode Holder | Ockenfels Syntech GmbH | ||
| Stimulus glass capillary Holder | Ockenfels Syntech GmbH | ||
| Universal Single Ended Probe | Ockenfels Syntech GmbH | ||
| 4-CHANNEL USB ACQUISITION CONTROLLER , IDAC-4 | Ockenfels Syntech GmbH | ||
| Stimulus Controllers | Ockenfels Syntech GmbH | Stimulus Controller CS 55 | |
| Personal Computer | Dell | Vostro | Check for compatibility with digital acquisition system and software |
| Tungsten Rod | A-M Systems | Cat#716000 | |
| Aluminum Foil and/or Faraday Cage | Electromagnetic noise shielding | ||
| Borosilicate Glass Capillaries | World Precision Instruments | 1B100F-4 | |
| Pipette Puller | Sutter Instrument Company | Model P-97 Flaming/Brown Micropipette Puller | |
| Stereomicroscope | Olympus | VMZ 1x-4x | For fly preparation |
| p200 Pipette Tips | Generic | ||
| Microloader tips | Eppendorf | E5242956003 | |
| 1 ml Syringe | Generic | ||
| Crocodile clips | |||
| Power Transformers | STACO ENERGY PRODUCTS | STACO 3PN221B | Assembled from P1000 pipette tips, flexible plastic tubing, and mesh |
| Modeling Clay | Generic | ||
| Forceps | Generic | ||
| Plastic Tubing | Saint Gobain | Tygon S3™ E-3603 | |
| Standard culture vials | Archon Scientific | Narrow 1-oz polystyrene vails, each with 10 mL of glucose medium, preloaded with cellulose acetate plugs | |
| Berberine chloride (BER) | Sigma-Aldrich | Cat# Y0001149 | |
| Denatonium benzoate (DEN) | Sigma-Aldrich | Cat# D5765 | |
| N,N-Diethyl-m- toluamide (DEET) | Sigma-Aldrich | Cat# 36542 |
Referências
- Joseph, R. M., Carlson, J. R. Drosophila chemoreceptors: a molecular interface between the chemical world and the brain. Trends Genet. 31 (12), 683-695 (2015).
- Montell, C. Drosophila sensory receptors-a set of molecular Swiss Army Knives. Genética. 217 (1), 1-34 (2021).
- Dweck, H. K. M., Carlson, J. R. Molecular logic and evolution of bitter taste in Drosophila. Curr Biol. 30 (1), 17-30 (2020).
- Weiss, L. A., Dahanukar, A., Kwon, J. Y., Banerjee, D., Carlson, J. R. The molecular and cellular basis of bitter taste in Drosophila. Neuron. 69 (2), 258-272 (2011).
- He, Z., Luo, Y., Shang, X., Sun, J. S., Carlson, J. R. Chemosensory sensilla of the Drosophila wing express a candidate ionotropic pheromone receptor. PLoS Biol. 17 (5), e2006619 (2019).
- Ling, F., Dahanukar, A., Weiss, L. A., Kwon, J. Y., Carlson, J. R. The molecular and cellular basis of taste coding in the legs of Drosophila. J Neurosci. 34 (21), 7148-7164 (2014).
- Falk, R., Bleiser-Avivi, N., Atidia, J. Labellar taste organs of Drosophila melanogaster. J Morphol. 150 (2), 327-341 (1976).
- Hiroi, M., Meunier, N., Marion-Poll, F., Tanimura, T. Two antagonistic gustatory receptor neurons responding to sweet-salty and bitter taste in Drosophila. J Neurobiol. 61 (3), 333-342 (2004).
- Shanbhag, S. R., Park, S. K., Pikielny, C. W., Steinbrecht, R. A. Gustatory organs of Drosophila melanogaster: fine structure and expression of the putative odorant-binding protein PBPRP2. Cell Tissue Res. 304 (3), 423-437 (2001).
- Siddiqi, O., Rodrigues, V. Genetic analysis of a complex chemoreceptor. Basic Life Sci. 16, 347-359 (1980).
- Clyne, P. J., Warr, C. G., Carlson, J. R. Candidate taste receptors in Drosophila. Science. 287 (5459), 1830-1834 (2000).
- Koh, T. W., et al. The Drosophila IR20a clade of ionotropic receptors are candidate taste and pheromone receptors. Neuron. 83 (4), 850-865 (2014).
- Sánchez-Alcañiz, J. A., et al. An expression atlas of variant ionotropic glutamate receptors identifies a molecular basis of carbonation sensing. Nat Commun. 9 (1), 4252 (2018).
- Dweck, H. K. M., Carlson, J. R. Diverse mechanisms of taste coding in Drosophila. Sci Adv. 9 (46), (2023).
- Chyb, S., Dahanukar, A., Wickens, A., Carlson, J. R. Drosophila Gr5a encodes a taste receptor tuned to trehalose. Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 14526-14530 (2003).
- Dahanukar, A., Lei, Y. T., Kwon, J. Y., Carlson, J. R. Two Gr genes underlie sugar reception in Drosophila. Neuron. 56 (3), 503-516 (2007).
- Delventhal, R., Carlson, J. R. Bitter taste receptors confer diverse functions to neurons. Elife. 5, e11181 (2016).
- Dweck, H. K. M., Talross, G. J. S., Luo, Y., Ebrahim, S. A. M., Carlson, J. R. Ir56b is an atypical ionotropic receptor that underlies appetitive salt response in Drosophila. Curr Biol. 32 (8), 1776-1787 (2022).
- Hiroi, M., Marion-Poll, F., Tanimura, T. Differentiated response to sugars among labellar chemosensilla in Drosophila. Zoolog Sci. 19 (9), 1009-1018 (2002).
- Jeong, Y. T., et al. An odorant-binding protein required for suppression of sweet taste by bitter chemicals. Neuron. 79 (4), 725-737 (2013).
- Jiao, Y., Moon, S. J., Montell, C. A Drosophila gustatory receptor required for the responses to sucrose, glucose, and maltose identified by mRNA tagging. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (35), 14110-14115 (2007).
- Jiao, Y., Moon, S. J., Wang, X., Ren, Q., Montell, C. Gr64f is required in combination with other gustatory receptors for sugar detection in Drosophila. Curr Biol. 18 (22), 1797-1801 (2008).
- Kim, S. H., et al. Drosophila TRPA1 channel mediates chemical avoidance in gustatory receptor neurons. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (18), 8440-8445 (2010).
- Lacaille, F., et al. An inhibitory sex pheromone tastes bitter for Drosophila males. PLoS One. 2 (7), e661 (2007).
- Lee, Y., et al. Gustatory receptors required for avoiding the insecticide L-canavanine. J Neurosci. 32 (4), 1429-1435 (2012).
- Lee, Y., Kim, S. H., Montell, C. Avoiding DEET through insect gustatory receptors. Neuron. 67 (4), 555-561 (2010).
- Lee, Y., Moon, S. J., Montell, C. Multiple gustatory receptors required for the caffeine response in Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (11), 4495-4500 (2009).
- Lee, Y., Moon, S. J., Wang, Y., Montell, C. A Drosophila gustatory receptor required for strychnine sensation. Chem Senses. 40 (7), 525-533 (2015).
- Meunier, N., Marion-Poll, F., Rospars, J. P., Tanimura, T. Peripheral coding of bitter taste in Drosophila. J Neurobiol. 56 (2), 139-152 (2003).
- Moon, S. J., Köttgen, M., Jiao, Y., Xu, H., Montell, C. A taste receptor required for the caffeine response in vivo. Curr Biol. 16 (18), 1812-1817 (2006).
- Moon, S. J., Lee, Y., Jiao, Y., Montell, C. A Drosophila gustatory receptor essential for aversive taste and inhibiting male-to-male courtship. Current Biology. 19, 1623-1627 (2009).
- Rimal, S., et al. Mechanism of acetic acid gustatory repulsion in Drosophila. Cell Rep. 26 (6), 1432-1442 (2019).
- Shim, J., et al. The full repertoire of Drosophila gustatory receptors for detecting an aversive compound. Nat Commun. 6, 8867 (2015).
- Xiao, S., Baik, L. S., Shang, X., Carlson, J. R. Meeting a threat of the Anthropocene: Taste avoidance of metal ions by Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 119 (25), e2204238119 (2022).
- Zhang, Y. V., Ni, J., Montell, C. The molecular basis for attractive salt-taste coding in Drosophila. Science. 340 (6138), 1334-1338 (2013).
- Delventhal, R., Kiely, A., Carlson, J. R. Electrophysiological recording from Drosophila labellar taste sensilla. J Vis Exp. (84), e51355 (2014).
- Marella, S., et al. Imaging taste responses in the fly brain reveals a functional map of taste category and behavior. Neuron. 49 (2), 285-295 (2006).
- Thorne, N., Amrein, H. Atypical expression of Drosophila gustatory receptor genes in sensory and central neurons. J Comp Neurol. 506 (4), 548-568 (2008).
- Wang, Z., Singhvi, A., Kong, P., Scott, K. Taste representations in the Drosophila brain. Cell. 117 (7), 981-991 (2004).
Citar este artigo
Dweck, H. K. M., Carlson, J. R. Base Recording: A Technique for Analyzing Responses of Taste Neurons in Drosophila. J. Vis. Exp. (205), e66665, doi:10.3791/66665 (2024).