Non-destructive SPE-UPLC-based Quantification of Aflatoxins and Stilbenoid Phytoalexins in Single Peanut (<i>Arachis</i> spp.) Seeds

Victor S Sobolev; Renee S Arias; Alicia N Massa; Travis E Walk; Valerie A Orner; Marshall C Lamb

doi:10.3791/66574

JoVE Journal > Biochemistry

Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.

Bioquímica

القياس الكمي غير المدمر القائم على SPE-UPLC للأفلاتوكسينات و Stilbenoid Phytoalexins في الفول السوداني المفرد (Arachis spp.) بذار

Published: April 19, 2024

doi:

10.3791/66574

Victor S Sobolev, Renee S Arias, Alicia N Massa, Travis E Walk, Valerie A Orner, Marshall C Lamb

¹National Peanut Research Laboratory, Agricultural Research Service,U.S. Department of Agriculture

Summary

نوضح طريقة متوسطة الإنتاجية لقياس كمية الأفلاتوكسينات وفيتواليكسين ستيلبينويد في بذور الفول السوداني المفردة باستخدام كروماتوغرافيا سائلة فائقة الأداء. تم تطوير هذه الطريقة خصيصا لتحليل أنواع Arachis البرية التي تتحدى أنواع Aspergillus الأفلاتوكسيجينية.

Abstract

الأفلاتوكسينات هي مستقلبات ثانوية مسرطنة للغاية لبعض الأنواع الفطرية ، وخاصة Aspergillus flavus. وكثيرا ما تلوث الأفلاتوكسينات السلع الزراعية الهامة اقتصاديا، بما في ذلك الفول السوداني، مما يشكل خطرا كبيرا على صحة الإنسان. بسبب القاعدة الوراثية الضيقة ، تظهر أصناف الفول السوداني مقاومة محدودة لمسببات الأمراض الفطرية. لذلك ، تلقى العديد من أنواع الفول السوداني البري التي تتحمل الرشاشيات اهتماما كبيرا من قبل العلماء كمصادر لمقاومة الأمراض.

من الصعب استكشاف الأصول الوراثية النباتية لمقاومة الأفلاتوكسينات لأن تراكم الأفلاتوكسين لا يتبع التوزيع الطبيعي ، مما يملي الحاجة إلى تحليل الآلاف من بذور الفول السوداني المفردة. بذور الفول السوداني الرطبة بما فيه الكفاية (Arachis spp.) ، عندما تصاب بأنواع الرشاشيات ، قادرة على إنتاج ستيلبينات نشطة بيولوجيا (ستيلبينويدس) التي تعتبر نباتية دفاعية. الفول السوداني stilbenes تمنع تطور الفطريات وإنتاج الأفلاتوكسين. لذلك ، من الأهمية بمكان تحليل نفس البذور ل stilbenoids الفول السوداني لشرح طبيعة مقاومة البذور / القابلية لغزو الرشاشيات . لا تقدم أي من الطرق المنشورة تحليلات أحادية البذور للأفلاتوكسينات و / أو فيتواليكسين ستيلبين.

حاولنا تلبية الطلب على مثل هذه الطريقة الصديقة للبيئة ، وتستخدم مواد استهلاكية غير مكلفة ، وحساسة وانتقائية. بالإضافة إلى ذلك ، فإن الطريقة غير مدمرة لأنها تستخدم نصف البذرة فقط وتترك النصف الآخر الذي يحتوي على المحور الجنيني سليما. تسمح هذه التقنية بإنبات ونمو نبات الفول السوداني حتى النضج الكامل من نفس البذور المستخدمة في تحليل الأفلاتوكسين و stilbenoid . الجزء المتكامل من هذه الطريقة ، التحدي اليدوي للبذور باستخدام Aspergillus ، هو خطوة مقيدة تتطلب مزيدا من الوقت والعمل مقارنة بالخطوات الأخرى في الطريقة. تم استخدام هذه الطريقة لاستكشاف الأصول الوراثية للأراكيس البري لتحديد الأنواع المقاومة ل Aspergillus وتحديد وتوصيف المصادر الجديدة للمقاومة الوراثية لهذا العامل الممرض الفطري.

Introduction

الفول السوداني (Arachis hypogaea L.) هو واحد من المحاصيل الغذائية الرئيسية في العالم. يزرع في أكثر من 100 دولة بإجمالي إنتاج يتجاوز 45 مليون^{طن 1}. غالبا ما يتم غزو السلع الزراعية ، مثل الفول السوداني والذرة وبذور القطن من قبل أنواع من Aspergillus ، الفطريات المولودة في التربة والتي تنتج الأفلاتوكسينات². هذه السلع معرضة بشكل خاص للتلوث بالأفلاتوكسين قبل الحصاد عندما تتميز الظروف البيئية بارتفاع درجات الحرارة والجفاف. الأفلاتوكسينات هي من بين أقوى المواد المسرطنة المعروفة³. إنها تلوث ربع السلع الزراعية في العالم⁴ مما يجعل حوالي نصف سكان العالم معرضين بشكل مزمن للأفلاتوكسينات⁵. نظرا لارتفاع نسبة السرطنة والسمية ، يتم تنظيم وجود الأفلاتوكسين في الغذاء عند أدنى الحدود المقبولة عمليا في معظم دول العالم⁶.

قام الاتحاد الأوروبي (EU) بتشريع مستوى أقصى قدره 2 نانوغرام للأفلاتوكسين B₁ و 4 نانوغرام / غرام لإجمالي الأفلاتوكسين (B₁ و B₂ و G₁ و G₂) في المنتجات للاستهلاك البشري⁷. وتضع هذه الحدود المنخفضة ضغطا كبيرا على الزراعة وصناعة الأغذية التي تعالج السلع الملوثة بالأفلاتوكسينات. يمكن اعتبار مراقبة الأفلاتوكسين وإعادة معالجة الفول السوداني الملوث استراتيجية سلبية ومكلفة لمنع الأفلاتوكسين من دخول السلسلة الغذائية. هذا هو السبب في أن جميع القطاعات الرئيسية في صناعة الفول السوداني تعاني من خسائر فادحة في الأرباح بسبب تلوث الأفلاتوكسين لأصناف الفول السوداني الحالية التي غالبا ما تظهر مقاومة محدودة للأمراض الفطرية. يتمثل النهج المستقبلي لحل مشكلة الأفلاتوكسين في الحصول على أصناف الفول السوداني المقاومة للفطريات من خلال إدخال الجينات ، أي نقل المعلومات الوراثية من أنواع الفول السوداني البري المقاومة إلى أصناف النخبة. في السنوات الأخيرة ^8,9 ، تلقت أنواع الفول السوداني البري اعتبارا كبيرا كمصادر لمقاومة الأمراض الوراثية لأن القاعدة الوراثية الضيقة للفول السوداني المزروع لم تعد قادرة على توفير المستوى المطلوب من سمات المقاومة لنبات الفول السوداني^10,11. يتطلب الإدخال الناجح من أنواع الفول السوداني البري تحليل الآلاف من البذور الصغيرة والنادرة (الشكل 1 أ) ¹².

الشكل 1: مخطط انسيابي لتحليل البذور الواحدة. (أ) الحجم المقارن لمختلف أصناف الفول السوداني من نوع السوق مقابل أنواع الأراكيس البرية (1) فرجينيا ؛ (2) عداء. (3) الإسبانية؛ (4) Arachis spp. (B) Arachis البري spp. (اللوحة A ، البذور 4) مقطعة إلى ثلاثة أقسام ، (5) نصف بذرة ذات محور جنيني ؛ يستخدم هذا الجزء من البذرة لزراعة نبات (ه). (ج) يحفر الجزءان (6) و(7) باستخدام مثقاب و(د) ملقحان بجراثيم فطرية. بعد الحضانة لمدة 72 ساعة عند 30 درجة مئوية ، يتم استخدام أحد أجزاء البذور ، (6) أو (7) لتحليل الأفلاتوكسين و phytoalexin ، ويتم استخدام جزء آخر لتسلسل الحمض النووي الريبي / النسخ. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

ترتبط مقاومة الفول السوداني لمسببات الأمراض الفطرية بقوة ب phytoalexins¹³^،¹⁴^،¹⁵^،¹⁶^،¹⁷. يتم تمثيل phytoalexins الفول السوداني بواسطة stilbenoids المضادة للميكروبات التي يتم تصنيعها حيويا وتتراكم في الأنسجة النباتية بعد التعرض للمنبهات الخارجية ، وخاصة للغزو الفطري¹⁶^،¹⁷^،¹⁸. التراكم السريع لتركيزات كافية من phytoalexins في موقع الغزو الفطري هو مثبط للنمو الفطري وهو أمر بالغ الأهمية للدفاع عن النبات¹⁹^،²⁰^،²¹. يتوقف العامل الممرض عن النمو عندما تتراكم phytoalexins إلى تركيزات مثبطة^16,22. تم تقييم دور stilbenoids كمركبات دفاعية ضد الفطريات الأفلاتوكسية في الفول السوداني منذ أكثر من 30 عاما في التجارب الميدانية¹³. دعمت هذه التجارب بوضوح الفرضية القائلة بأن ستيلبينويدس الفول السوداني عامل مقاومة حاسم في تلوث الأفلاتوكسين قبل الحصاد. وتستند هذه الأدلة إلى الحقائق القائلة بأن ستيلبينات تنتج بشكل طبيعي في الفول السوداني التالف في الحقول. تظهر Stilbenes نشاطا بيولوجيا ملحوظا ضد الفطريات الأفلاتوكسيجينية ؛ ولم يتم الكشف عن تلوث الأفلاتوكسين في البذور إلا عندما فقد الفول السوداني القدرة على تخليق phytoalexin بسبب جفاف البذور الناجم عن الجفاف. أكدت مجموعة أخرى من التجارب الميدانية العلاقة بين إنتاج phytoalexin ومقاومة النمط الوراثي للفول السوداني لأمراض الفول السوداني المهمة زراعيا¹⁷.

إن الفهم الأفضل للآلية الطبيعية القائمة على phytoalexin لمقاومة الفول السوداني للغزو الفطري هو استراتيجية واعدة للسيطرة على تلوث الأفلاتوكسين^15,17.لذلك ، بالإضافة إلى تحليلات الأفلاتوكسين ، من المهم إجراء تحليل كمي لنفس البذور بحثا عن phytoalexins. على الرغم من أن آلية المقاومة هذه لم يتم بحثها وفهمها بشكل كامل ، إلا أنها ضرورية لتربية نباتات الفول السوداني وتعديلها وراثيا لأصناف جديدة مقاومة للفطريات²³. على الرغم من وجود إجراءات تحليلية مختلفة لتحديد الأفلاتوكسين في سلع مختلفة ، لا تزال هناك حاجة إلى طرق بسيطة لإجراء أبحاث محددة ، خاصة عندما لا تفي الطرق التقليدية بالمتطلبات التحليلية والفعالة من حيث التكلفة. معظم طرق التنظيف الحديثة المستخدمة في صناعة الفول السوداني والزراعة والمختبرات الخاصة هي أجهزة²⁴ القائمة على الأجسام المضادة والمقايسة المناعية²⁵^،²⁶^،²⁷. إنها انتقائية وحساسة ولكنها أغلى بكثير من الأعمدة الصغيرة المعبأة بمواد ماصة شائعة. وبالإضافة إلى ذلك، لم تصمم أي من هذه الطرق لتحليل عينات قليلة الوزن بالملليغرام. استنادا إلى بحثنا السابق حول الاستخدام التحليلي للأعمدة الصغيرة المعبأة بهلام السيليكا المغنيسيوم (Florisil)²⁸ ، قمنا بتعديل هذا الإجراء ليناسب احتياجات برامج ما قبل التكاثر والتربية المستمرة والمستقبلية.

كان الغرض من هذا العمل هو تطوير طريقة غير مدمرة ومتوسطة الإنتاجية وصديقة للبيئة للتحديد الكمي للأفلاتوكسينات و phytoalexins في بذور الفول السوداني المفردة. تم تطوير هذه الطريقة. مزاياها على الطرق المنشورة هي حساسية أعلى ، والقدرة على تحليل الأفلاتوكسينات و phytoalexins في مستخلص بذرة واحدة ، وعدم الحاجة إلى وزن العينات ، وانخفاض التكلفة بفضل كميات أصغر من المواد الاستهلاكية. يظهر مخطط التدفق للطريقة المتكاملة في الشكل 1. تم ذكر التحليلات الجينية والخطوات الأخرى في هذا النص وتم توضيحها في الشكل لإظهار أهمية الطريقة المقترحة وكيفية دمجها مع الإجراء بأكمله.

Protocol

1. تحضير البذور للتحدي الفطري احتضان فطر الرشاشيات فلافوس NRRL 3357 الأفلاتوكسيجينيك على مائل من أجار سكر العنب (PDA) في أنبوب اختبار لمدة 6 أيام عند 30 درجة مئوية. احصد الجراثيم الفطرية من أنبوب الاختبار مع 10 مل من الماء باستخدام Tween 20 (100 ميكرولتر من Tween في 1 لتر من الماء المعقم المقطر) ، وقم بالتصفية من خلال الصوف الزجاجي الموضوعة في قمع وعد الجراثيم باستخدام مقياس الدم الذي يشير إلى دليل المستخدم. خفف معلق البوغ بالماء المعقم إلى تركيز 1000 جرثومة / ميكرولتر. تأكيد التركيز مع مقياس الدم.ملاحظة: قم بإعداد تعليق البوغ في موعد لا يتجاوز 2 ساعة قبل التجارب الصعبة. اكسر قرون الفول السوداني برفق وقم بإزالة الهياكل. ضع البذور في دورق معقم بحيث لا يتجاوز حجم البذور 1/5 من حجم الدورق ، وأضف 0.05٪ من محلول بيروكسيد الهيدروجين إلى حوالي 70٪ من حجم الدورق ، واترك البذور تشرب الماء لمدة 3 ساعات. صب محلول بيروكسيد الهيدروجين من البذور وأضف ما يقرب من 3 أضعاف كمية 80٪ من خليط الإيثانول والماء (v / v) إلى الدورق لتغطية البذور. اتركيه لمدة دقيقة ثم اشطفي البذور 2x بكميات متساوية من الماء المقطر المعقم. أضف حجما 5 أضعاف من بيروكسيد الهيدروجين بنسبة 3٪ إلى الدورق مع البذور المعقمة بالإيثانول واتركه لمدة 5 دقائق ، ثم صب السائل واشطف البذور مرتين بكميات متساوية من الماء المعقم (الشكل 2 أ). الشكل 2: تحضير بذور الفول السوداني لتلقيح وحضانة واستخلاص أجزاء الأفلاتوكسين والفيتوالكسين. (أ) تعقيم البذور المشبعة بنسبة 3٪ بيروكسيد الهيدروجين؛ (ب) إزالة الخصية (الجلد) من البذور؛ (ج) قطع جزء المحور الجنيني؛ (D ، E) تجويف الحفر في نصف فلقة مع مثقاب ؛ (و) وضع أجزاء محفورة من البذور على أجار ؛ (ز) وضع جراثيم فطرية في التجويف المحفور. (ح) طبق بتري مع البذور بعد الحضانة ؛ (ط) وضع بذور مفردة محتضنة (صورة لعينات التحكم) في أنابيب خرز مقواة ؛ (ي) إضافة الحجم المقاس من مذيب الاستخلاص ؛ (ك) سحق العينات في جهاز تمزق الخرزة؛ (L) الطرد المركزي للطين المسحوق. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. ضع البذور على منشفة ورقية معقمة ، وأزل تيستا البذور بالملقط ، واقطع حوالي 1/3 من البذرة التي تحتوي على المحور الجنيني بمشرط (الشكل 2 ب ، ج). تخلص من هذا الجزء من البذرة أو استخدمه لزراعة نبات في أنبوب اختبار بوسط نمو (الشكل 1 ب ، ه). قسم الجزء المتبقي من البذرة إلى فلقتين ، وضعها في طبق بتري ، وقم بتغطية أجزاء البذور بورق ترشيح معقم رطب ، واستبدل الغطاء لتجنب الجفاف وانتقل على الفور إلى خطوة التلقيح. قبل إجراء التجارب الصعبة ، قم بإعداد عدد كاف من أطباق بتري مع وسط حضانة البذور عن طريق صب 26 مل من أجار معقم 1.5٪ في الماء في أطباق 100 × 15 مم والسماح لها بالتصلب طوال الليل. في منتصف الجانب الخارجي لكل فلقة متبقية ، قم بعمل تجويف بعمق 1.5-2 مم عن طريق حفر البذور يدويا باستخدام مثقاب حاد معقم بقطر 1.6-2.34 مم. يستغرق ~ 2-5 ثانية لعمل تجويف (الشكل 2D ، E). ضع 4 إلى 6 قطع “محفورة” من البذور في طبق بتري مع أجار وقم بتطبيق 2 ميكرولتر من 1000 جرثومة / ميكرولتر معلقة في التجويف المحفور لكل قطعة نصف نبتة باستخدام ماصة 10 ميكرولتر. بدلا من تعليق البوغ ، ضع الماء المعقم على بذور التحكم (الشكل 2F ، G). غطي جميع أطباق بتري بأغطية واحتضانها عند 30 درجة مئوية بدون ضوء لمدة 72 ساعة. 2. أخذ عينات وإعداد قطع البذور المحتضنة لتحليل الأفلاتوكسين والفيتواليكسين اجمع قطع البذور في 72 ساعة عن طريق إزالتها من أجار بالملقط ووضع كل منها في قارورة خرز 7 مل مع 13 حبة سيراميك زركونيوم (12 قطرها 2.8 مم وقطرها 1 6.5 مم) (الشكل 2H ، I).ملاحظة: في هذه المرحلة ، إذا لم تتم معالجتها على الفور ، يمكن وضع القوارير في الفريزر -80 درجة مئوية والاحتفاظ بها لمدة تصل إلى 2 أشهر قبل مزيد من المعالجة. يتم تحديد Phytoalexins والأفلاتوكسين في نفس مستخلص البذور. للاستخراج ، اعتمادا على حجم البذور المرئي (صغير أو متوسط أو كبير) ، أضف 2 أو 4 مل من خليط الميثانول والماء المقاس بدقة (90:10 ، v / v) إلى قوارير الخرز وسحقها بسرعة 5.5 م / ثانية لمدة 45 ثانية. ضع القوارير مع البذور المسحوقة في جهاز طرد مركزي وأجهزة طرد مركزي عند 1860 × جم لمدة 3 دقائق (الشكل 2J – L).ملاحظة: يتم تحديد مشتقات ستيلبينويد المهمة التالية17،22 (كلها في التكوين العابر): ريسفيراترول ، أراكيدين -1 ، أراكيدين -2 ، أراكيدين -3 ، 3′-إيزوبنتادينيل-3،5،4′-ثلاثي هيدروكسي ستيلبين (IPD) ، و SB-1. لتحليلات الأفلاتوكسين ، قبل إجراء التجارب الصعبة ، قم بإعداد عدد كاف من أعمدة التنظيف على النحو التالي. ضع فريت بولي إيثيلين مسامي مطابق (20 ميكرولتر) في عمود بولي بروبيلين سعة 1.5 مل بمساعدة قضيب زجاجي مقطوع بزاوية 90درجة مئوية. ضع 50 مجم من هلام السيليكا المغنيسيوم (100-200 شبكة) في العمود باستخدام مغرفة مصنوعة خصيصا وقم بتغطية العمود بقضيب زجاجي متطابق عن طريق دفعه لأسفل بقضيب زجاجي (الشكل 3A – E).ملاحظة: تحتل هذه الكمية من هلام السيليكا المغنيسيوم حجم 75 ميكرولتر ، وارتفاع الطبقة الممتزة 3 مم. الشكل 3: إعداد أعمدة التنظيف والمرشحات. (أ ، ب) وضع فريت مسامي في البرميل ؛ (C ، D) ملء برميل مع هلام السيليكا المغنيسيوم. (ه) تعبئة المادة الممتزة وإدخال فريت مسامي علوي في البرميل. (F) وضع دائرة من الألياف الزجاجية بقطر 11.5 مم فوق ماصة باستور. (ز ، ح) دفع مركز الدائرة بقضيب بلاستيكي أو خشبي لأسفل إلى أسفل برميل ماصة باستور وضغط الألياف الزجاجية بإحكام. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. في هذه المرحلة ، قم بإعداد عدد مطابق من المرشحات المخصصة كما هو موضح في الشكل 3F – H. بالنسبة لتحليلات الأفلاتوكسين ، قم بقياس ما يصل إلى 0.5 مل من القسمة الطافية بدقة (تم الحصول عليها كما هو موضح في الخطوة 2.2) ، وانقلها إلى العمود الصغير المعبأ خصيصا ، واسمح للمستخلص بالتصريف عن طريق الجاذبية في قنينة زجاجية سعة 4 مل. انقل 1.0 مل من خليط الميثانول والماء (90:10 ، v / v) إلى العمود لغسل الشوائب بالجاذبية في نفس القارورة 4 مل (الشكل 4 أ). الشكل 4: تنقية مستخلصات البذور والتحضير لتحليلات UPLC. (أ) رف مع أعمدة معبأة. (ب) تبخير المذيب بغاز N2 من ست قوارير سعة 4 مل مع مستخلص منقى مستخلص من أعمدة التنظيف. (ج) إحضار القوارير والمرشحات إلى درجة حرارة تحت الصفر في حاويات الرغوة (1 و 2) مع الثلج قبل وبعد إضافة مذيب الحقن (MeOH-H2O 9: 1 ، v / v) إلى قوارير 4 مل. (د) ترشيح المستخلص المبرد من قنينة سعة 4 مل إلى قنينة أخذ العينات الأوتوماتيكية سعة 400 ميكرولتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. تخلص من الشطف المركب. تخلص من جزء الأفلاتوكسين عن طريق الجاذبية من العمود إلى قنينة زجاجية نظيفة سعة 4 مل مع خليط 1.2 مل من الأسيتون – الأسيتونيتريل – الماء – 88٪ حمض الفورميك (65: 31: 3.5: 0.5 ، v / v) خليط (الشكل 4 أ). بدلا من ذلك ، قم بإزالة الأفلاتوكسينات من العمود ب 2.0 مل من خليط الأسيتونيتريل – الماء – 88٪ حمض الفورميك (96: 3.5: 0.5 ، v / v) ، وحقن حصة من الشطف ، حتى 2 ميكرولتر ، مباشرة في نظام الكروماتوغرافيا السائلة فائقة الأداء (UPLC) (بدون تبخر المذيب مع N2).ملاحظة: في هذه الحالة ، توقع ما يصل إلى 10 أضعاف الحد الكمي أقل للأفلاتوكسينات ؛ في معظم الحالات ، يكون هذا الانخفاض في الحساسية مقبولا لأن تركيزات الأفلاتوكسين في البذور المطعون فيها غالبا ما تكون عالية. قم بإزالة المذيب من القوارير في تيار من N2 في كتلة ساخنة عند 45 درجة مئوية. قم بتغطية القارورة وضعها في وعاء به ثلج مجروش لمدة 30-45 ثانية لتقليل تبخر المذيب المضاف في الخطوة التالية. ضع المرشحات المصنوعة حسب الطلب في أنابيب اختبار يمكن التخلص منها وأدخل الأنابيب في الثلج في حاوية أخرى لتقليل تبخر المذيب عند الترشيح (الشكل 4B ، C). بعد تبخر المذيب ، قم بإذابة البقايا الجافة في قياس دقيق 0.25-1.0 مل من خليط الميثانول والماء (90:10 ، v / v) والدوامة لمدة 1-2 ثانية. ضع قوارير مع مستخلصات منقاة في أخذ العينات الأوتوماتيكي UPLC وحقن 0.1 إلى 3.0 ميكرولتر في نظام UPLC (الشكل 5A ، B).ملاحظة: إذا اشتبه في أن المحلول بعد الدوامة يحتوي على بعض الجسيمات العالقة ، فقم بتصفية المحلول من خلال المرشح المبرد (الشكل 4D). الشكل 5: عملية ونتائج تحليلات UPLC للمستخلصات المنقى. (أ) وضع رف مع مستخلصات عينات منقاة في جهاز أخذ العينات الأوتوماتيكي UPLC. (ب) إجراء التحليلات الآلية والحصول على البيانات وتفسير النتائج. (ج) اتحاد البلدان النامية لأربعة أفلاتوكسينات رئيسية؛ تمثل القمم الرئيسية المثيرة للاهتمام ، الأفلاتوكسين B1 و B2 0.04 و 0.004 نانوغرام على التوالي. (د) UPLC من الأفلاتوكسينات B1 و B2 ؛ تمثل الذروة 2 الأفلاتوكسين B1 عند مستوى 2 بيكوغرام (مع خلية تدفق 8 ميكرولتر). (ه) UPLC من مستخلص منقى من بذور يتم حصادها من حقل فول سوداني محلي مع أنواع أراكيس برية. (F) UPLC لمستخلص بذور الفول السوداني المطعون فيها المنقاة بعمود صغير أساسي من أكسيد الألومنيوم. (ز) UPLC لمستخلص بذور الفول السوداني المطعون فيها المنقى بعمود فلوريسيل؛ يعرض الكروماتوجرام الأزرق الشوائب التي يتم غسلها من العمود بمزيج 1 مل من خليط ماء الميثانول (90:10 فولت / فولت) ؛ يظهر الكروماتوجرام الأسود قمم الأفلاتوكسينات M1 و B1. مستوى الأفلاتوكسين B1 هو 48 نانوغرام / غرام. (H) كروماتوجرام نموذجي لستيلبينويدس الفول السوداني من بذرة مطعون فيها ؛ اختصار: IPD = 3′-إيزوبنتادينيل-3،5،4′-ثلاثي هيدروكسي ستيلبين. ملاحظة: جميع stilbenoids في مستخلصات البذور في التكوين العابر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. لتحليلات phytoalexin ، من كل قارورة حبة ، انقل 200 ميكرولتر من المادة الطافية إلى مرشح ماصة باستور أعلاه. استخدم غاز N2 من خزان النيتروجين المضغوط لتسريع الترشيح في قارورة أخذ العينات الأوتوماتيكية UPLC سعة 400 ميكرولتر وقم بتغطية القارورة بغطاء مطابق مع حاجز PTFE (الشكل 4D). 3. تحليلات الأفلاتوكسين لفصل الأفلاتوكسينات في مستخلصات البذور ، استخدم نظام UPLC المجهز بجهاز أخذ عينات تلقائي ، ومضخة رباعية ، وكاشف فلورسنت ، و UPLC BEH C18 3.0 مم × 100 مم ، وعمود 1.7 ميكرومتر مع عمود مسبق مطابق ، ومفاعل كيميائي ضوئي بعد العمود (PHRED) مع ملف PTFE محبوك قياسي 0.25 قطر داخلي مقطوع إلى 25٪ من طوله الأصلي.ملاحظة: يتم سرد أداة UPLC والمعدات المرتبطة بها المستخدمة من قبل المؤلفين في جدول المواد. استخدم الماء (A) والميثانول (B) والأسيتونيتريل (C) في التدرج التالي: الظروف الأولية ، 62.7٪ A ، 24٪ B ، 13.3٪ C ، تغيرت خطيا إلى 30٪ A ، 45٪ B ، 25٪ C في 3.75 دقيقة ، تغيرت إلى 0٪ A ، 64.4٪ B ، 35.6٪ C في 3.751 دقيقة ، عقدت متساوية لمدة 3.249 دقيقة ، ثم تغيرت إلى الظروف الأولية في 0.01 دقيقة وعقدت متساوية لمدة 2.499 دقيقة قبل الحقن التالي. اضبط معدل التدفق على 0.45 مل / دقيقة ووقت التشغيل على 9.5 دقيقة. حافظ على العمود عند 40 درجة مئوية في سخان عمود النظام. استخدم 362 نانومتر و 440 نانومتر كأطوال موجية للإثارة والانبعاث ، على التوالي ، للقياس الكمي للأفلاتوكسين B1 و B2 و G1 و G2 و M1 . يوضح الشكل 6 أ هياكل الأفلاتوكسينات الرئيسية.ملاحظة: في ظل الظروف التجريبية ، من المتوقع إنتاج الأفلاتوكسينات B1 و B2 فقط بواسطة A. flavus NRRL 3357 ؛ إذا تم استخدام سلالة A. parasiticus لتحدي البذور ، فمن المتوقع إنتاج الأفلاتوكسينات B1 و B2 و G1 و G2 . تحديد تركيزات الأفلاتوكسينات بالرجوع إلى مناطق الذروة للمعايير الأصلية المقابلة (منحنى المعايرة) كما هو موضح في دليل مستخدم البرنامج.ملاحظة: نظرا لأن إجراء UPLC يظهر ضوضاء خط الأساس في إعدادات الحساسية العالية لكاشف الفلورسنت ، يتم تقييم حد الكشف (LOD) والحد الكمي (LOQ) للأفلاتوكسينات باستخدام نسبة الإشارة إلى الضوضاء المقبولة على نطاق واسع وهي 3: 1 ل LOD و 10: 1 ل LOQ. في الإعداد التجريبي الروتيني لتحليل بذور الفول السوداني ، الموصوف في القسمين 2 و 3 ، من المتوقع أن تكون حدود التكميم للأفلاتوكسين G1 و B1 أقل أو تساوي 0.8 و 0.08 نانوغرام / غرام للأفلاتوكسين G2 و B2 ، على التوالي. 4. تحليلات ستيلبينويد فيتواليكسين لفصل stilbenoids ، استخدم الماء (A) والميثانول (B) و 88٪ حمض الفورميك (C) في التدرج التالي: الظروف الأولية ، 53٪ A ، 42٪ B ، 5٪ C ، تغيرت خطيا إلى 35٪ A ، 60٪ B ، 5٪ C في 2.0 دقيقة ، عقدت متساوية لمدة 4 دقائق ، تغيرت إلى 0٪ A ، 95٪ B ، 5٪ C في 0.5 دقيقة ، عقدت isocratic لمدة 2.5 دقيقة ، ثم تغيرت إلى الظروف الأولية في 0.1 دقيقة وعقدت isocratic لمدة 2.9 دقيقة قبل الحقن التالي. اضبط معدل التدفق على 0.5 مل / دقيقة ووقت التشغيل على 12.0 دقيقة. تحديد تركيزات stilbenoids بالرجوع إلى مناطق الذروة للمعايير الأصلية المقابلة (منحنى المعايرة) و / أو المعاملات المنشورة للانقراض المولي كما هو موضح في دليل مستخدم البرنامج. يوضح الشكل 6 ب تراكيب الفيوتالكسينات الرئيسية المشتقة من الستيلبين.ملاحظة: يتم فصل فيتواليكسين باستخدام نفس النظام ولكن بدون كاشف فلورسنت ومفاعل PHRED. بدلا من ذلك ، يتم استخدام كاشف صفيف الصمام الثنائي للكشف عن ستيلبينويدس الفول السوداني وتحديده. الحد الكمي (LOQ) ل phytoalexins stilbenoid الرئيسي ليس له معنى عملي لأن تركيزات stilbenoid تتجاوز تركيزات الأفلاتوكسينات في نفس المستخلص ببعض أوامر الحجم. بعد 3 أيام من الحضانة ، يتم تحديد كمية stilbenoids بشكل موثوق.

Representative Results

الطريقة المطورة لتكميم الأفلاتوكسين في البذور هي جوهر الإجراء الكامل لتقييم أنواع الفول السوداني البري لمقاومة تراكم الأفلاتوكسين. توفر الأعمدة الصغيرة والمرشحات المعبأة حسب الطلب وفورات كبيرة وتبسط الإجراء العام بسبب نقص كميات كبيرة من المذيبات ، والمرشحات التجارية المكلفة وغير الضرورية 0.22 أو 0.45 ميكرومتر ، وأجهزة الضخ. توفر طريقة تحليل الأفلاتوكسين عمليات استرداد عالية ودقة ودقة ضمن النطاق المختبر من 1.0-50.0 نانوغرام / غرام من الأفلاتوكسين من البذور المطحونة كما هو موضح في الجدول 1. تم تخفيف العينات شديدة التلوث إلى القيمة الخطية المختبرة. يوضح الشكل 5C فصلا أساسيا لأربعة أفلاتوسينات رئيسية ، B1 و B2 و G1 و G2 في غضون 5 دقائق من وقت الشطف ، وهو أمر مقبول لأن التحدي الفطري لبذور الفول السوداني هو المرحلة المحددة للإجراء وليس تحليلات UPLC. الطريقة المقترحة حساسة بما فيه الكفاية مع حد كمي يبلغ 2 بيكوغرام للأفلاتوكسين B1 (الشكل 5D). تسمح النقاء العالي للمستخلصات بتقدير كمي لا لبس فيه للأفلاتوكسينات كما يتضح من UPLC (الشكل 5E) من المستخلص المنقى للبذور التي يتم حصادها من حقل به أنواع أراكيس برية. طريقة العمودالمصغر المنشورة سابقا 29 غير قادرة على تحقيق نقاء مرض لبذور الفول السوداني التي تتحدى الفطريات (الشكل 5F) مقارنة بالطريقة المقترحة (الشكل 5G). من الشكل 5F ، من الواضح أن الأفلاتوكسينات B2 و G1 و G2 لا يمكن اكتشافها وقياسها بشكل موثوق بسبب وجود تركيزات عالية من الشوائب المتداخلة ، وكثير منها ، المستخلصة بعد الأفلاتوكسينات ، هي فيتواليكسين ستيلبينويد ومستقلبات فطرية. في المقابل ، يوضح الشكل 5G الكفاءة العالية لعمود هلام السيليكا المغنيسيوم في إزالة الشوائب من جزء الأفلاتوكسين. يعرض الكروماتوجرام الأزرق شوائب متداخلة يتم غسلها من العمود بمزيج 1 مل من خليط الميثانول والماء (90:10) ؛ يظهر الكروماتوجرام الأسود قمم غير محجوبة من الأفلاتوكسينات M1 و B1. يمثل هذا الكروماتوجرام مستخلص بذور الأنواع البرية التي تم تحديها. مستوى الأفلاتوكسين B1 هو 48 نانوغرام / غرام. يعد القياس الكمي لفيتواليكسين الفول السوداني إضافة قيمة لتحليلات الأفلاتوكسينات في نفس البذرة ، والتي قد تكون بذرة طبيعية من حقل أو بذرة تتحدى الفطريات. يوضح الشكل 5H مخططا نموذجيا ل stilbenoids الدفاعية للفول السوداني من بذرة تم تحديها. يتم تحقيق فصل المركبات باستخدام نفس العمود التحليلي المستخدم في تحليلات الأفلاتوكسين. يوفر العمود والظروف الكروماتوغرافية المختارة فصلا مرضيا للقمم مما يسمح بتقدير كمية موثوقة من stilbenoids. إن تقييم العلاقة بين الأفلاتوكسين والفيتواليكسين في البذور التي تم تحديها خارج نطاق هذا العرض التقديمي والطريقة مقترحة هنا كأداة بحث محتملة ، والتي تم استخدامها في مختبر المؤلفين لعدة سنوات وأثبتت فائدتها. <!– Figure 1: Single-seed analysis flowchart. (A) Comparative size of different market-type peanut cultivars vs. wild Arachis spp. (1) Virginia; (2) runner; (3) Spanish; (4) wild Arachis spp. (B) Wild Arachis spp. seed 4 cut into three sections, (5) half seed with embryonic axis; this portion of the seed is used to grow a plant (E). (C) Parts (6) and (7) are drilled with a drill bit and (D) inoculated with fungal spores. After incubation for 72h at 30 oC, one of the seed parts, (6) or (7) is used for aflatoxin and phytoalexin analyses, and another is used for RNA/transcriptome sequencing. Please click here to view a larger version of this figure. Figure 2: Preparation of peanut seeds for inoculation, incubation, and extraction of aflatoxin and phytoalexin fractions. (A) Sterilizing imbibed seeds with 3% hydrogen peroxide; (B) removing skins from seeds; (C) cutting off the embryonic axis part; (D,E) drilling cavity in a half cotyledon with a drill bit; (F) placing drilled parts of seeds on agar; (G) applying fungal spored into drilled cavity. (H) Petri dish with seeds after incubation; (I) placing incubated single seeds (photo of control samples) into beading vials; (J) adding measured volume of extracting solvent; (K) pulverizing samples in a bead raptor; ( L) centrifugation of pulverized slurry. Please click here to view a larger version of this figure. Figure 3: Preparation of cleanup columns and filters. (A,B) Placing a porous frit into barrel; ( C,D) filling barrel with magnesium silica gel; (E) packing the adsorbent and inserting a top porous frit into barrel. (F) Placing an 11.5 mm dia. glass fiber circle on top of a Pasteur pipette. (G,H) Pushing the center of the circle with a plastic or wooden rod down to the bottom of the Pasteur pipette barrel and firmly compacting the glass fiber. Please click here to view a larger version of this figure. Figure 4:Purification of seed extracts and preparation for the UPLC analyses. (A)Rack with packed columns. (B) Evaporating solvent with N2 gas from six 4 mL vials with purified extract eluted from cleanup columns. (C) Bringing vials and filters to a subzero temperature in foam containers (1 and 2) with ice before and after addition of the injection solvent (MeOH-H2O 9:1, v/v) to the 4-mL vials. (D) Filtering cooled extract from a 4-mL vial into a 400 µL autosampler vial. Please click here to view a larger version of this figure. Figure 5: The process and results of UPLC analyses of purified extracts. (A) Placing a rack with purified sample extracts into UPLC autosampler. (B) Performing the instrumental analyses, obtaining data, and interpreting results. (C) UPLC of four major aflatoxins; the major peaks of interest, aflatoxins B1 and B2 represent 0.04 and 0.004 ng, respectively. (D) UPLC of aflatoxins B1 and B2; peak 2 represents aflatoxin B1 at a 2 pg level (with an 8 µL flow sell). (E) UPLCof purified extract of a seed harvested from a local peanut field with a wild Arachis species. (F) UPLC ofthe extract of a challenged peanut seed purified with a basic aluminum oxide minicolumn. (G)UPLC of the extract of challenged peanut seed purified with a Florisil column; blue chromatogram presents impurities that are washed from the column with 1 mL of methanol-water (90:10 v/v) mixture; black chromatogram shows peaks of aflatoxins M1 and B1. The level of aflatoxin B1 is 48 ng/g. (H) Atypical chromatogram of peanut stilbenoids from a challenged seed; abbreviation: IPD = 3′-isopentadienyl-3,5,4′-trihydroxystilbene. Note: All stilbenoids in seed extracts are in trans-configuration. Please click here to view a larger version of this figure. –> الشكل 6: هياكل الأفلاتوكسينات الرئيسية وفيتواليكسين الفول السوداني المشتق من الستيلبين. (أ) هياكل الأفلاتوكسينات الرئيسية: 1 ، ب1 ؛ 2 ، ب2 ؛ 3 ، ز1 ؛ 4 ، ز2. (ب) هياكل فيتواليكسينات الفول السوداني الرئيسية المشتقة من الستيلبين: 6 ، ريسفيراترول ؛ 7 ، الأراكيدين -1 ؛ 8 ، الأراشيدين-2 ؛ 9 ، أراشيدين -3 ؛ 10 ، IPD (3 ′-إيزوبنتادينيل-3،5،4′-ثلاثي هيدروكسي ستيلبين) ؛ 11 ، SB-1. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. مستوى الارتفاعأ(نانوغرام / ز) الأفلاتوكسينات ب1 ب2 ز1 ز2 50 85.87 (0.97) 82.33 (0.67) 86.63 (2.89) 84.01 (0.86) 5 91.43 (2.76) 87.32 (0.47) 88.08 (2.08) 87.73 (0.77) 1 81.21 (3.16) 85.33 (1.98) 81.76 (4.66) 88.46 (3.24) الجدول 1: استعادة الأفلاتوكسينات من بذور الفول السوداني باستخدام عمود فلوريسيل و 1.2 مل من خليط شطف جزء الأفلاتوكسين. [يعني (SD) ، ٪ ؛ n = 5]. تم رفع العينات الأرضية الخالية من الأفلاتوكسين (50 جم) من صنف الفول السوداني Georgia 06G بالتساوي بمساعدة حقنة صغيرة بمحلول مخزون الأفلاتوكسين عند مستوى 50 أو 5 أو 1 نانوغرام / جم ، وتركت في درجة حرارة الغرفة لمدة 16 ساعة. ( أ ) تعطى مستويات سبايك للأفلاتوكسين B1 و G1 ؛ بالنسبة للأفلاتوكسين B2 و G2 ، يجب استخدام عامل الضرب 0.33.

Discussion

بناء على تجربتنا السابقة²⁸ ، قمنا بتطوير إجراء كيميائي بسيط وغير مكلف وصديق للبيئة ومناسب لاستكشاف مجموعات الأصول الوراثية للأراكيس البري لتحديد الأنواع المقاومة ل Aspergillus وتحديد وتوصيف مصادر جديدة للمقاومة الجينية لهذه الفطريات الانتهازية. تعتمد هذه الطريقة على تنقية مستخلص البذور بواسطة تقنية استخراج الطور الصلب (SPE) والقياس الكمي للأفلاتوكسين بواسطة كروماتوغرافيا السائل فائقة الأداء (UPLC) وتتميز بالاسترداد والدقة والدقة العالية بما فيه الكفاية. طريقة “Florisil” المقترحة هي تعديل لإجراء تنظيف العمود المصغر الفردي الذي يعتمد على الخاصية الفريدة ل Florisil (هلام السيليكا المغنيسيوم) للاحتفاظ بقوة وانتقائية بالأفلاتوكسينات²⁸. كما هو الحال في الطريقة الأصلية ، تم استخراج عينات البذور بمزيج MeOH-H₂O ولكن بنسبة مختلفة من 90:10 (v / v) مقارنة ب 80:20 المنشورة (v / v). أدى هذا التغيير إلى زيادة معدل تدفق المذيبات عبر عمود التنظيف حتى 2.5x بنفس معدل استرداد الأفلاتوكسين. قدم خليط الميثانول والماء 90:10 (v / v) استردادا بنسبة 100٪ تقريبا لمعايير الأفلاتوكسين B₁ و B₂ و G₁ و G₂المضافة إلى استخلاص المذيب عند مستويات سبايك تعادل 5-50 نانوغرام من تركيزات الأفلاتوكسين في 1 جم من الركيزة ، بالإضافة إلى توفير عمليات استرداد عالية بما فيه الكفاية من عينات بذور الفول السوداني المسننة (الجدول 1).

لقد ثبت أنه يمكن استخلاص الأفلاتوكسينات من مادة Florisil الممتزة فقط بكميات كبيرة من الأسيتون³⁰ ، الأسيتون والميثانول^31,32 ، ومخاليط الأسيتون والماء 33,34,35,36. في سياق البحث الحالي ، اكتشفنا أن الأسيتونيتريل المحمض يتصرف بشكل مشابه للأسيتون في قدرته على إزالة الأفلاتوكسينات من فلوريسيل. على حد علمنا ، لم يتم الإبلاغ عن خاصية الأسيتونيتريل هذه في الأدبيات. يسمح اكتشاف هذه الخاصية بحقن المستخلص المنقى مباشرة في نظام UPLC مع حذف خطوة تبخر المذيبات ، مما يقلل بشكل كبير من وقت التحضير. حتى عندما تم خلط الأسيتونيتريل مع الأسيتون (الأسيتون – الأسيتونيتريل – الماء – 88٪ حمض الفورميك (65: 31: 3.5: 0.5 ، v / v)) ، فإنه يوفر إزالة سلسة وكاملة وسريعة للمياه من الشطف المنقى مما يقلل بشكل كبير من وقت تبخر المذيبات. سمح وجود الأسيتونيتريل باستخدام مذيب واحد ، خليط من الميثانول والماء (90:10 ، v / v) لإزالة الشوائب بشكل فعال من عمود Florisil مقارنة بالطريقة المنشورة ، حيث كانت هناك حاجة إلى مذيبين إضافيين للغسيل ، الميثانول وخليط الكلوروفورم والميثانول. ²⁸

في المتوسط ، كان استرداد الأفلاتوكسين B₁ القياسي ~ 98٪ عند استخدام 1.2 مل لشطف الأفلاتوكسينات. تم اختيار كمية 50 ملغ من Florisil بحيث يملأ 1.2 مل من مذيب الشطف العمود الصغير إلى أعلى البرميل ، وفي الوقت نفسه ، يوفر استردادا مرضيا (الجدول 1). يعمل هذا الأسلوب على تسريع إجراء التنظيف حيث يجب ملء برميل العمود مرة واحدة فقط. في المراحل الأولى من هذا المشروع ، لم يكن من الواضح ما إذا كان جزء Florisil التجاري بحجم جسيم كبير نسبيا ، 100-200 شبكة ، سيكون مناسبا لعمود صغير يحتوي على طبقة 3 مم فقط من المادة الممتزة. لذلك ، استكشفنا كسور Florisil المختلفة التي تم الحصول عليها من منتج شبكي تجاري 100-200 باستخدام غرابيل الاختبار القياسية الأمريكية 120-140 و 140-170 و 170-200 و 200-270 و 270-400 و >400 شبكة. كل هذه الكسور قدمت نتائج قابلة للتكرار ، ومطابقة تقريبا مع انتعاش مرض. على الرغم من أن الأجزاء الأصغر حجما من الجسيمات أظهرت نطاقات أفلاتوكسين أضيق في العمود تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية ، إلا أن هذه الكسور لم تكن متفوقة بأي شكل من الأشكال على المنتج التجاري 100-200 شبكة. بالإضافة إلى ذلك ، أظهر الكسر الشبكي 100-200 أقصر أوقات شطف (8-12 دقيقة) للإجراء بأكمله.

سمح توصيل المذيبات UPLC المتدرج بالفصل المرضي للأفلاتوكسينات وكذلك الإزالة الكاملة للشوائب غير القطبية من العمود (الشكل 5G). أدى هذا النهج إلى تشغيل عمود لا تشوبه شائبة ونتائج قابلة للتكرار لتحليلات مئات العينات. تم تأكيد هوية الأفلاتوكسينات المستخلصة من عمود Florisil كما هو موضح سابقا. ²⁸ أظهر عمود UPLC التحليلي بقطر 3 مم المستخدم هنا انتقائية أعلى وفصلا أكثر موثوقية للأفلاتوكسينات B₁ و B₂ و G₁ و G₂ بتركيزات أعلى مقارنة بالعمود الذي يبلغ قطره 2.1 مم من نفس الكيمياء. علاوة على ذلك ، كان طول عمر العمود 3 مم (أكثر من 1200 حقنة) أعلى بكثير من طول عمر العمود 2.1 مم (حتى 800 حقنة). على الرغم من أن العمود 3 مم يتطلب معدلا أعلى للطور المتحرك (40٪ أكثر) ، فقد تفوقت المزايا المذكورة أعلاه للعمود على هذا العيب.

كان العمود الصغير Florisil فعالا في تنقية مستخلصات بذور الفول السوداني الملوثة بشدة بمستقلبات Aspergillus (الشكل 5G) ؛ تحتوي هذه البذور أيضا على مستويات عالية من فيتواليكسين ستيلبينويد التي أنتجتها البذور استجابة للغزو الفطري. كل هذه الشوائب قد تتجاوز تركيز الأفلاتوكسين في البذور حتى 10⁶ أضعاف²² ، مما يجعل هذه البذور تتحدى الأشياء لتحليل الأفلاتوكسين. يوضح الشكل 5G عدم وجود قمم متداخلة في الكروماتوجرام خلال أوقات الاحتفاظ بالأفلاتوكسين ، مما جعل اكتشاف الأفلاتوكسين وقياسه غير منقوص على جميع المستويات التي تم اختبارها (الجدول 1). كما هو موضح في الجدول 1 ، كانت دقة ودقة الطريقة عالية بما فيه الكفاية ضمن النطاق المختبر من 1.0-50.0 نانوغرام / غرام ، وهو أيضا النطاق الأكثر أهمية للكشف عن الأفلاتوكسين. كانت عمليات الاسترداد على مستويات مختلفة لمختلف الأنماط الوراثية للفول السوداني البري موحدة وكانت الانحرافات المعيارية لخمسة عمليات استخراج مختلفة منخفضة بشكل أساسي.

تم اختبار الطريقة أيضا على بذور الفول السوداني والقطن والذرة والأرز الملوثة بشكل طبيعي من صفر إلى مستويات عالية للغاية – أكثر من 10000 نانوغرام / غرام من إجمالي الأفلاتوكسينات. تراوح استرداد الأفلاتوكسينات B₁ و B₂ و G₁ و G₂ من الذرة وبذور القطن والأرز عند مستوى 5 نانوغرام / غرام من 76.1٪ إلى 93.7٪ و 77.1٪ إلى 86.6٪ و 90.5٪ إلى 96.2٪ على التوالي. كان أعلى استرداد للأفلاتوكسين من الأرز مصحوبا ب “نقاء” eluent ، أي عدم وجود أي شوائب تقريبا. علاوة على ذلك ، يمثل الأرز أصغر جسم واحد تم اختباره ، في المتوسط ، 19 مجم / بذور.

لم يتجاوز إجمالي وقت التحضير لبذرة فول سوداني واحدة (بما في ذلك القصف والوزن والاستخراج والطرد المركزي والتنقية) باستخدام عمود Florisil 20 دقيقة. تكلفة العمود الصغير Florisil أقل >10 مرات من تكلفة أعمدة التنظيف التجارية. تستمد الوفورات الإضافية من استخدام كميات أقل من الممتزات والمذيبات وغاز النيتروجين مقارنة بالإجراء المنشور²⁸. لا يتطلب العمود الصغير أجهزة ضخ أو تفريغ للعمل وله مدة صلاحية غير محددة.

يعد استكشاف الأصول الوراثية النباتية لمقاومة الأفلاتوكسينات أمرا صعبا للغاية لأن تراكم السموم الفطرية لا يتبع التوزيع الطبيعي^37,38 ؛ هناك حاجة إلى عدد كبير من تحليلات الأفلاتوكسين في البذور المفردة للتغلب على هذه الظاهرة. بالإضافة إلى محتوى الأفلاتوكسين ، فإن المعلومات المتعلقة بتكوين phytoalexin الكمي ذات قيمة عالية في ضوء مجموعة كبيرة من المعلومات التي يمكن الحصول عليها من بذرة واحدة (الشكل 1 أ) وتتبعها إلى نبات معين (الشكل 1E). تم استخدام هذه الطريقة بنجاح لفحص مئات المدخلات بما في ذلك السلالات الأصلية وسلالات التربية المتقدمة وأصناف الفول السوداني النخبة. يقترح استخدام هذه الطريقة في برامج أبحاث ما قبل التكاثر والتربية للفول السوداني وقد تساعد في توصيف جينات الفول السوداني لمقاومة الفطريات.

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

تلقى هذا العمل الدعم المالي من مشروع USDA-ARS CRIS 6044-42000-011-00D ومشروع CRIS 6044-21000-005-000-D. نشكر دان تود على صنع الرف الصغير. إن ذكر الأسماء التجارية أو المنتجات التجارية في هذه المقالة هو فقط لغرض توفير معلومات محددة ولا يعني توصية أو تأييد من وزارة الزراعة الأمريكية.

Materials

Acetone, Optima	Fisher Scientific	A929-4
Acetonitrile, Optima	Fisher Scientific	A996-4
Acquity BEH C18 2.1 x 5mm Van-Guard pre-column	Waters Corporation	186003975
Acquity BEH C18 3 x 100mm column	Waters Corporation	186004661
Acquity BEH C18 2.1 x 100mm column	Waters Corporation	186002352
Aflatoxins B1, B2, G1, and G2	Sigma-Aldrich	A9441-1VL	Dissolve the contents of the commercial vial in 5 mL of methanol to obtain 5 µg/mL for aflatoxins B1 and G1 and 1.5 µg/mL for B2 and G2
Aflatoxin B1 (1mg)	Sigma-Aldrich	A6636-1MG
Aflatoxin B2 (1mg)	Sigma-Aldrich	A9887-1MG
Aflatoxin G1 (1mg)	Sigma-Aldrich	A0138-1MG
Aflatoxin G2 (1mg)	Sigma-Aldrich	A0263-1MG
Aflatoxin M1 (10 µg)	Sigma-Aldrich	CRM46319
Agar, Granulated (2kg)	Becton Dickinson	BD214510
Alumina oxide basic (60-325 mesh)	Fisher Scientific	A941-500
Basal medium	Murashige and Skoog	M5519
Bead Ruptor 24	Omni International	19-042E
Beaker (1000mL)	Corning (Pyrex)	10001L
Beaker (250mL)	Corning (Pyrex)	1000250
Beaker (400mL)	Corning (Pyrex)	1000400
Beaker (600mL)	Corning (Pyrex)	1000600
Blade, scalpel	Feather	#10
Centrifuge (LSE Compact)	Corning	Model: 6755
Centrifuge, micro	Corning	Model: 6770
Ceramic beads (2.8 mm)	Omni International	19-646
Ceramic beads (6.5 mm)	Omni International	19-682
Chromeleon 7 series Software	Thermo Scientific
Drill bit	Kyocera	07896	1.6 mm
Drill bit	Kyocera	07357	2.0 mm
Drill bit	Kyocera	07985	2.34 mm
Ethanol (200 proof)	Decon Labs	2805M
Evaporator, nitrogen	organimation	11106	6-position
Excel, Microsoft	Microsoft	Office 365
Filter paper (#4)	Cytiva Whatman	1004-090
Filter paper cutter, stainless steel (ID 11.5mm)	Unknown
Filter paper, glass fibre	Cytiva Whatman	934-AH
Flask (2800mL)	Corning (Pyrex)	44202XL
Florisil (100-200 mesh)	Fisher Scientific	F101-500
Forceps	Integra Lifescience (Miltex)	PM-0300
Formic acid (88%, ACS)	Fisher Scientific	A118P-500
Freezer (-80^oC)	Fisher Scientific	TSX70086D
Funnel (15 x 80mm)	DWK Life Sciences (Kimax)	2902060
Gelzan (medium)	Caisson Labs	G024
Glass rod (custom)	Custom made
Glass wool	Corning (Pyrex)	3950
Handle, scalpel	Feather	#7
Hemocytometer	Hausser Scientific	3100
Hydrogen peroxide	Fisher Scientific	H325-4	30%, Certified ACS
Ice bucket, round with lid	Corning	432122
Incubator	Percival	136VL
Kimtech SCIENCE Brand Kimwipes	Kimtech	34120	8.2" x 4.39"
Kimtech SCIENCE Brand Kimwipes	Kimtech	34256	16.4" x 14.43"
Lab coat	Cenmed	B113660SBXL
Methanol, Optima	Fisher Scientific	A454-4
Mini column rack (custom)	Custom made
Mixer, touch (maxi mix II)	Thermolyne	37600 (model 231)
Nitrile gloves	Microflex	XC310M
Nitrogen gas, compressed (ultra high purity)	Jones Welding
Paper towel	Georgia-Pacific	20023 (D400)
pH meter	Fisher Scientific (Accumet)	13-636-AB15
pH/ATC electrode	Fisher Scientific (Accumet)	13-620-111
PhCR Photochemical Reactor	Waters (Vicam)	600001222
Pipette, pasteur	Fisher Scientific	13-678-20D	9"
Pipettor (1 mL) (Reference 2)	Eppendorf	4924000088
Pipettor (10 μL) (Reference)	Eppendorf	022470051D
Pipette tips: 10 μL, 200 μL, 1 mL	Eppendorf	F144054M
Pipettor (200 µL)(Ergofit)	Fisher Scientific	12-146-679
Plates, petri (100x15mm)	Fisher Scientific	FB0875713
Potato Dextrose Agar (500g)	Becton Dickinson	BD213400
Reinforced bead tube (2 mL)	Omni International	19-660
Reinforced bead tube (7 mL)	Omni International	19-651
Repipettor, Dispensette III (10mL)	Brandtech	4701141
Resveratrol	Sigma-Aldrich	R5010-100MG
Scoop (custom)	Custom made
screwcap jar (250 mL)	Corning (Pyrex)	1395250
Silica gel, spherical (200-400 mesh)	Supelco	97727-U	100 g
Sodium Hydroxide	Fisher Scientific	S318-500
SPE extract clean 1.5-mL polypropylene column	American Chromotography Supplies	SP-5122382
SPE extract clean PP frits (for 1.5 mL minicolumn)	American Chromotography Supplies	SP-3119414
Spectrophotometer, UV-visible	Fisher Scientific	14-385-351 (Genesys 50)
Test tube	Corning (Pyrex)	982516X	16x125mm
Test tube (Disposable)(16x125mm)	Fisher Scientific	14-961-31
Test tube (Disposable)(150x250mm)	Fisher Scientific	14-961-34
Thermo Vanquish DAD detector (UPLC)	Thermo Scientific	VF-D11-A-01
Thermo Vanquish Fluourescense detector (UPLC)	Thermo Scientific	VF-D51-A
Thermo Vanquish quaternary pump F (UPLC)	Thermo Scientific	VF-P20-A
Thermo Vanquish Split Sampler FT (UPLC)	Thermo Scientific	VF-A10-A-02
Tween 20 (polysorbate 20) (enzyme grade)	Fisher Scientific	BP337-500
Vial caps (4mL)	Fisher Scientific	C4015-75A
Vial caps (autosampler)	Fisher Scientific	C4010-60A
Vials & caps (16 mL)	Thermo Scientific	B7800-4
Vials, glass (4mL)	Fisher Scientific	C4015-1
Vials, polypropylene (autosampler) (400mL)	Fisher Scientific	C4010-11
Water, Optima	Fisher Scientific	W6-4

Referências

Janila, P., et al. Molecular breeding for introgression of fatty acid desaturase mutant alleles (ahFAD2A and ahFAD2B) enhances oil quality in high and low oil containing peanut genotypes. Plant Sci. 242, 203-213 (2016).
Rasooly, R., Hernlem, B., He, X., Friedman, M. Non-linear relationships between aflatoxin B1 levels and the biological response of monkey kidney vero cells. Toxins (Basel). 5 (8), 1447-1461 (2013).
American Association for Cancer Research: AACR. An evaluation of chemicals and industrial processes associated with cancer in humans based on human and animal data: IARC Monographs Volumes 1 to 20. Cancer Res. 40 (1), 1-12 (1980).
Turner, P. C. The molecular epidemiology of chronic aflatoxin driven impaired child growth. Scientifica. , 21 (2013).
Williams, J. H., et al. Human aflatoxicosis in developing countries: a review of toxicology, exposure, potential health consequences, and interventions. Am. J. Clin. Nutr. 80 (5), 1106-1122 (2004).
van Egmond, H. P., Jonker, M. A., Abbas, H. K. Worldwide regulations on aflatoxins. Aflatoxinandfood safety. , 77-93 (2005).
European Commission. Commission Regulation (EC) 1525/98. Off. J. Eur. Comm. L. 201, 43-46 (1998).
Bressano, M., et al. Introgression of peanut smut resistance from landraces to elite peanut cultivars (Arachis hypogaea L). PLoS ONE. 14 (2), e0211920 (2019).
de Blas, F. J., et al. Identification of smut resistance in wild Arachis species and its introgression into peanut elite lines. Crop Sci. 59 (4), 1657-1665 (2019).
Mallikarjuna, N., Pande, S., Jadhav, D. R., Sastri, D. C., Rao, J. N. Introgression of disease resistance genes from Arachis kempff-mercadoi into cultivated groundnut. Plant Breeding. 123 (6), 573-576 (2004).
Moretzsohn, M. C., et al. Genetic diversity of peanut (Arachis hypogaea L.) and its wild relatives based on the analysis of hypervariable regions of the genome. BMC Plant Biol. 4, 1-10 (2004).
Arias, R. S., et al. New tools to screen wild peanut species for aflatoxin accumulation and genetic fingerprinting. BMC Plant Biol. 18 (1), 170 (2018).
Dorner, J. W., Cole, R. J., Sanders, T. H., Blankenship, P. D. Interrelationship of kernel water activity, soil temperature, maturity, and phytoalexin production in preharvest aflatoxin contamination of drought-stressed peanuts. Mycopathologia. 105 (2), 117-128 (1989).
Paxton, J. D., Sharma, R. P., Salunkhe, D. K. Biosynthesis and accumulation of legume phytoalexins. Mycotoxins and phytoalexins. , 485-499 (1991).
Cole, R. J., Dorner, J. W., Sharma, R. P., Salunkhe, D. K. Peanut phytoalexins. Mycotoxins and phytoalexins. , 501-509 (1991).
Subba Rao, P. V., Strange, R. N., Daniel, M., Purkayastha, R. P. Chemistry, biology, and role of groundnut phytoalexins in resistance to fungal attack. Handbook of phytoalexin metabolism and action. , 199-227 (1995).
Sobolev, V. S., Guo, B. Z., Holbrook, C. C., Lynch, R. E. Interrelationship of phytoalexin production and disease resistance in selected peanut genotypes. J. Agric. Food. Chem. 55 (6), 2195-2200 (2007).
Paxton, J. Phytoalexins: a working redefinition. J. Phytopathol. 101, 106-109 (1981).
Mansfield, J. W., Bailey, J. A., Mansfield, J. W. The role of phytoalexins in disease resistance. Phytoalexins. , 153-288 (1982).
Strange, R. N., Ayers, P. G. Resistance: the role of the hypersensitive response and phytoalexins. Plant response to foliar pathogens. , 39-56 (1992).
Sobolev, V. S., et al. Biological activity of peanut (Arachis hypogaea) phytoalexins and selected natural and synthetic stilbenoids. J. Agric. Food Chem. 59 (5), 1673-1682 (2011).
Sobolev, V. S. Localized production of phytoalexins by peanut (Arachis hypogaea) kernels in response to invasion by Aspergillus Species. J. Agric. Food Chem. 56 (6), 1949-1954 (2008).
Sobolev, V. S., Neff, S. A., Gloer, J. B. New stilbenoids from peanut (Arachis hypogaea) seeds challenged by an Aspergillus caelatus strain. J. Agric. Food Chem. 57 (1), 62-68 (2009).
Trucksess, M. W., et al. Immunoaffinity column coupled with solution fluorometry or liquid chromatography postcolumn derivatization for determination of aflatoxins in corn, peanuts, and peanut butter: collaborative study. J. AOAC Int. 74 (1), 81-88 (1991).
Dorner, J. W., Blankenship, P. D., Cole, R. J. Performance of two immunochemical assays in the analysis of peanuts for aflatoxin at 37 field laboratories. J. AOAC Int. 76 (3), 637-643 (1993).
Stroka, J., Anklam, E. Immunoaffinity column cleanup with liquid chromatography using post-column bromination for determination of aflatoxins in peanut butter, pistachio paste, fig paste, and paprika powder: collaborative study. J. AOAC Int. 83 (2), 320-340 (2000).
Pal, A., Acharya, D., Saha, D., Roy, D., Dhar, T. K. In situ sample cleanup during immunoassay: a simple method for rapid detection of aflatoxin B1 in food samples. J. Food Prot. 68 (10), 2169-2177 (2005).
Sobolev, V. S. Simple, rapid, and inexpensive cleanup method for quantitation of aflatoxins in important agricultural products by HPLC. J. Agric. Food Chem. 55 (6), 2136-2141 (2007).
Sobolev, V. S., Dorner, J. W. Cleanup procedure for determination of aflatoxins in major agricultural commodities by liquid chromatography. J. AOAC Int. 85 (3), 642-645 (2002).
Levi, C. P., Borker, E. Survey of green coffee for potential aflatoxin contamination. J. AOAC. 51 (3), 600-602 (1968).
Levi, C. P. Collaborative study on a method for detection of aflatoxins B1 in green coffee beans. J. AOAC. 52 (6), 1300-1303 (1969).
Scott, P. M. Note on analysis of aflatoxins in green coffee. J. AOAC. 51, 609 (1968).
Bicking, M. K. L., Kniseley, R. N., Svec, H. J. Coupled-column system for quantitating low levels of aflatoxins. J. AOAC. 66 (4), 905-908 (1983).
Kamimura, H., et al. Simple, rapid cleanup method for analysis of aflatoxins and comparison with various methods. J. AOAC. 68 (3), 458-461 (1985).
Hoogenboom, L. A., et al. Genotoxicity testing of extracts from aflatoxin-contaminated peanut meal, following chemical decontamination. Food Addit. Contam. 18 (4), 329-341 (2001).
Castro, L., Vargas, E. A. Determining aflatoxins B1, B2, G1 and G2 in maize using Florisil clean up with thin layer chromatography and visual and densitometric Quantitation. Cienc. Tecnol. Ailment. Campinas. 21, 115-122 (2001).
Arias, R. S., Dang, P. M., Sobolev, V. S. RNAi-mediated Control of Aflatoxins in Peanut: Method to Analyze Mycotoxin Production and Transgene Expression in the Peanut/Aspergillus Pathosystem. J. Vis. Exp. (106), e53398 (2015).
Whitaker, T. B., Dorner, J. W., Giesbrecht, F. G., Slate, A. B. Variability among aflatoxin test results on runner peanuts harvested from small field plots. Peanut Sci. 31 (1), 59-63 (2004).

Play Video

PDF

DOI

DOWNLOAD MATERIALS LIST

Citar este artigo

Sobolev, V. S., Arias, R. S., Massa, A. N., Walk, T. E., Orner, V. A., Lamb, M. C. Non-destructive SPE-UPLC-based Quantification of Aflatoxins and Stilbenoid Phytoalexins in Single Peanut (Arachis spp.) Seeds. J. Vis. Exp. (206), e66574, doi:10.3791/66574 (2024).