射血分数保留的高脂血症诱导心力衰竭小鼠模型

该动物方案由迈阿密大学机构动物护理和使用委员会 （IACUC） 批准，符合美国国立卫生研究院 （NIH） 指南（IACUC 协议 23-103-ad03）。在本研究中，129J 背景的野生型 （WT） 小鼠是从商业来源（见 材料表）获得并在内部繁殖的。所有小鼠均为129J背景上的同窝小鼠。实验包括雄性和雌性小鼠。LDLR/P-407 HFpEF 小鼠通过在第 1 周给药单剂量 AAV9-cTnT-LDLR 和每两周给药 p407 四周来建立。 1. AAV9-cTnT-LDLR的制备和给药 注：AAV9-cTNT-hLDLR质粒（参见 材料表）编码完整的人LDLR蛋白（2664bp）（图1）。 AAV-LDLR病毒载体制备根据动物的数量，将AAV9储备瓶在冰上解冻20分钟，然后在Dulbecco磷酸盐缓冲盐水（DPBS）中稀释AAV颗粒，以获得100μL中1×10 12 个载体基因组/小鼠的浓度。 将病毒溶液放入 1 mL 注射器上的 28-30 G 针头中。注意避免将气泡吸入针头。 静脉注射 （i.v.） 尾静脉注射程序将氧气打开至 0.5 L/min，并将异氟烷麻醉系统设置为 4%-5%。将小鼠置于诱导室中~2分钟，直到动物没有反应。 将动物放在小鼠尾巴照明器限制器上（例如，Braintree Scientific，Inc.（马萨诸塞州布伦特里）），并将动物放在侧卧。使用异氟烷麻醉至2%-3%进行维持。注意：限制装置的加热将导致小鼠尾静脉扩张，因此更容易注射。 识别侧尾静脉。使用纱布垫用防腐剂清洁注射区域。 握住尾巴的末端以伸展它，然后用手指按摩鼠标尾巴，直到可以看到静脉。以低角度（10-15度角）插入针头，并将100μL稀释的AAV注射到尾静脉中（图2A）。 拔出针头并立即用手指施加压力，直到出血停止。将鼠标放回原来的笼子里。 2. P-407的准备和管理 P-407 准备通过在通风橱内用 DPBS 将 P-407 试剂（参见 材料表）稀释至终浓度为 100 mg/mL 来制备溶液。将溶液在4°C下在旋转器上冷藏过夜，以促进P-40710的溶解。 每两周一次腹膜内 （ip） 注射程序在腹腔内注射的第一天称重每只小鼠。使用公式1g / kg，根据重量和预填充注射器计算每只小鼠的适当剂量。 在通风橱下，手动约束鼠标，头部和身体向下倾斜，以便在颅骨上重新定位内部器官。这种技术避免了刺穿附近的重要结构。 识别腹部下象限的左腹膜腔，位于中线外侧。用消毒剂清洁现场。 以 45 度角或更小的角度将针头插入腹膜腔（图 2B）。吸出注射器以确保充分插入。 如果抽吸时有血液或组织，请拔出针头并重复步骤 2.2.2 -2.2.4，直到注射器透明。将针头丢弃在适当的锐器容器中，然后将鼠标放回原来的笼子中。 3.超声心动图评估 制备在成像前一天或前几个小时将脱毛膏涂抹在小鼠的胸部和上腹部。2分钟后用湿纱布去除奶油。 用2.5%-3.0%异氟烷以0.8L / min的流速麻醉小鼠，并用1%-1.5%异氟烷维持。然后，将鼠标以仰卧姿势固定在适当的平台上，爪子放在装有导电凝胶的电极垫上，并用鼻锥覆盖鼻子和嘴巴，以确保用异氟醚持续麻醉。 胸骨旁长轴视图将鼠标置于仰卧位，将平台的右侧倾斜 45 度。 接下来，将传感器探头对准轨道系统中，从右上肢到左腹以顺时针方向倾斜 30-40 度，以获得并存储 B 模式图像。 使用超声分析软件（参见 材料表）分析B模式图像以获得射血分数（图3A）。 胸骨旁短轴视图将导轨系统中的传感器探头顺时针旋转 90 度，以获取并存储 B 模式和 M 模式图像。 顶端视图将平台的左上角向下并向右倾斜。将换能器朝向动物的右肩。 在 B 模式和彩色多普勒模式下可视化二尖瓣。采集和存储脉冲波 （PW） 多普勒和组织多普勒图像5. 使用超声分析软件分析PW多普勒和组织多普勒图像，以获得IVRT，E / E’和E / A（图3B-E）。 4. 压力-容积（PV）回路数据记录 在研究结束时进行血流动力学分析，以评估左心室 （LV） 收缩压和舒张功能，遵循先前描述的程序11,12。首先用异氟烷（3-5%，诱导室）诱导小鼠。 当麻醉作用开始时，将动物转移到手术台上，并用异氟烷（1-3%，面罩）保持麻醉。 在颈部上方的皮肤上做一个小切口，以便进行气管插管（通过口腔）。 使用设置为~0.15-0.2mL体积和120-170呼吸/分钟的呼吸频率的啮齿动物呼吸机（例如，Micro vent model 848，Harvard Apparatus）用氧气和异氟醚的混合物给动物通风。 在整个手术过程中，使用温控手术台监测 ~37 °C ± 1 °C 的体温。 用 30 G 针头暴露并插管左颈内静脉，用于液体支持给药。 切开正中腹颈部位的皮肤，露出颈动脉。右颈动脉远端部分闭塞后，在动脉上做一个小切口，以便将微尖端压力容积 （PV） 导管（见 材料表）引入左心室（闭合胸部入路）。 记录稳态和下腔静脉闭塞期间的 PV 循环。 在实验结束时，使用经批准的 AVMA 方法（例如，异氟烷，然后颈椎脱位）对动物进行人道安乐死（在深度麻醉下）。 使用 LabChart 软件（参见 材料表）分析 PV 数据，并使用超声心动图测量校准体积。