Biolumineszenz-Resonanz-Energietransfer (BRET)-basierter Assay zur Messung der Wechselwirkungen von CRAF mit 14-3-3-Proteinen in lebenden Zellen

RAF-Kinasen (ARAF, BRAF und CRAF) sind die direkten Effektoren der RAS-GTPasen und die initiierenden Mitglieder der pro-proliferativen/überlebensfördernden RAF-MEK-ERK-Kinase-Kaskade. Jüngste Studien haben gezeigt, dass die CRAF-Expression eine Schlüsselrolle bei der Tumorgenese mehrerer KRAS-getriebener Krebsarten spielt, darunter nicht-kleinzelliger Lungenkrebs und duktales Adenokarzinom^der Bauchspeicheldrüse 1,2,3,4,5. Darüber hinaus verursachen Keimbahn-CRAF-Mutationen eine besonders schwere Form der RASopathie, das Noonan-Syndrom ^6,7. Das Verständnis der CRAF-Regulation ist entscheidend für die Entwicklung erfolgreicher therapeutischer Ansätze, die auf seine Funktion in Zellen abzielen.

Alle RAF-Kinasen können in zwei funktionelle Domänen unterteilt werden, eine C-terminale katalytische (CAT) Domäne und eine N-terminale regulatorische (REG) Domäne, die ihre Aktivität steuert (Abbildung 1A)⁸. Die REG-Domäne umfasst die RAS-Bindungsdomäne (RBD), die Cystein-reiche Domäne (CRD) und eine serin/Threonin-reiche Region (S/T-reich). Bemerkenswert ist, dass die S/T-reiche Region die N’-Stelle enthält, die phosphorylierungsabhängig an 14-3-3 bindet (S259 in CRAF; Abbildung 1A) ⁸. Die CAT-Domäne umfasst die Kinase-Domäne zusammen mit einer zweiten hochaffinen 14-3-3-Andockstelle, die als C’-Stelle bezeichnet wird (S621 in CRAF; Abbildung 1A) ⁸. Die differentielle Bindung von dimeren 14-3-3-Proteinen an die N’- und C’-Stellen spielt zusammen mit der CRD eine entscheidende Rolle sowohl bei der RAF-Aktivierung als auch bei der Hemmung 9,10,11,12,13. Unter normalen Signalbedingungen wird die RAF-Aktivierung durch seine Rekrutierung an die Plasmamembran durch RAS initiiert, wodurch aktive Dimere gebildet werden können, von denen das BRAF-CRAF-Heterodimer die vorherrschende aktive Form^{ist 14,15}. Biochemische Assays mit BRAF und CRAF sowie kryogene Elektronenmikroskopie-Strukturen (Kryo-EM) von dimerem BRAF deuten darauf hin, dass ein 14-3-3-Dimer aktive RAF-Dimere stabilisiert, indem es gleichzeitig an die C’-Stelle beider RAF-Protomere bindet (Abbildung 1B)9,13,16,17. Umgekehrt haben Studien gezeigt, dass RAF unter Ruhebedingungen eine zytosolische, autoinhibierte Bestätigung annimmt, bei der die REG-Domäne an die CAT-Domäne bindet und deren Aktivität hemmt 12,18,19,20. Dieser geschlossene Zustand wird durch ein 14-3-3-Dimer stabilisiert, das an die CRD- und N’-Stelle in der REG-Domäne und an die C’-Stelle in der CAT-Domäne gebunden ist (Abbildung 1B)10,13,21. Bei BRAF wird dieses Modell durch neuere Kryo-EM-Strukturen von autoinhibierten BRAF-Monomeren und durch unsere früheren biochemischen Studien^unterstützt 10,12,13,21,22. Während jedoch gezeigt wurde, dass 14-3-3 eine hemmende Rolle bei der CRAF-Regulation^{spielt 23}, könnte ein BRAF-ähnlicher autoinhibierter Zustand eine geringere Rolle bei der CRAF-Regulation spielen¹²; daher sind weitere Studien erforderlich, um die Mechanismen zu klären, durch die 14-3-3-Proteine die CRAF-Aktivität regulieren. Die 14-3-3-vermittelte Regulation von RAF-Kinasen erfordert eine Vielzahl von RAF-Phosphorylierungs- und Dephosphorylierungsereignissen, die Bindung an verschiedene regulatorische Proteine und Wechselwirkungen mit der Plasmamembran⁸. Daher ist es wichtig, dass 14-3-3-RAF-Wechselwirkungen unter physiologisch relevanten Bedingungen und in Gegenwart einer intakten Lipiddoppelschicht gemessen werden.

Um dieses Problem zu lösen, wurde die NanoBRET-Technologie (im Folgenden als N-BRET bezeichnet; siehe Materialtabelle für Details zum Kit) eingesetzt, um einen näherungsbasierten Assay zur Messung der Wechselwirkungen von CRAF mit 14-3-3-Proteinen in lebenden Zellen zu entwickeln (Abbildung 1C). Dieses BRET-basierte System misst die Wechselwirkungen von zwei Proteinen von Interesse (POI), wobei ein Protein mit einem Nanoluciferase (Nano)-Donor und das andere mit einem Halo-Tag markiert wird, um mit dem Halo618-Energieakzeptorliganden^22,24 markiert zu werden. Die Interaktion der interessierenden Proteine führt zu einem Energietransfer von Donor zu Akzeptor, der wiederum das BRET-Signal erzeugt (Abbildung 1C). Das extrem helle Nano-Donorprotein (Emission (em) 460 nm) und der Halo618-Ligand (em 618 nm) bieten eine größere spektrale Trennung und Empfindlichkeit als herkömmliche BRET, was es zu einer idealen Plattform für die Untersuchung schwächerer Wechselwirkungen und den Nachweis subtiler Änderungen in der Bindung^{macht 24}. In der Tat haben wir zuvor einen N-BRET-basierten Assay zur Messung der autoinhibitorischen Wechselwirkungen der RAF REG- und CAT-Domänen entwickelt, der für die Charakterisierung einer Reihe von RASopathie-Mutationen in der BRAF-CRD unerlässlich war und die entscheidende Bedeutung dieser Domäne für die Aufrechterhaltung der Autoinhibition und die Verhinderung der konstitutiven BRAF-Aktivierung demonstrierte¹².

Der hier beschriebene Assay misst die Wechselwirkungen von CRAF, das mit einem N-terminalen Nano-Tag (Nano-CRAF) fusioniert ist, und der Zeta-Isoform von 14-3-3, die mit einem C-terminalen Halo-Tag fusioniert ist (14-3-3ζ-Halo; Abbildung 1C). Wir zeigen, dass die Wechselwirkungen von Nano-CRAF mit 14-3-3ζ-Halo ein robustes BRET-Signal erzeugen, das wiederum durch Mutationen gestört werden kann, die eine Bindung von 14-3-3 an die N’-Stelle (S259A) und/oder die C’-Stelle (S621A) verhindern. Das folgende Protokoll enthält detaillierte Schritte zur Durchführung, Optimierung und Fehlerbehebung dieses Assays.