该方案描述了一种基于 BRET 的测定法,用于测量 CRAF 激酶与活细胞中 14-3-3 蛋白的相互作用。该协议概述了准备细胞、读取 BRET 发射和数据分析的步骤。还提供了一个示例结果,其中确定了适当的对照和分析优化的故障排除。
CRAF 是 RAS GTP 酶的主要效应子,在几种 KRAS 驱动的癌症的肿瘤发生中起关键作用。此外,CRAF 是种系突变的热点,种系突变被证明会导致发育性 RASopathy、Noonan 综合征。所有 RAF 激酶都包含 14-3-3 调节蛋白的多个磷酸化依赖性结合位点。14-3-3 与这些位点的差异结合在信号转导条件下质膜上活性 RAF 二聚体的形成和在静止条件下维持 RAF 自抑制中起着重要作用。了解这些相互作用如何被调节以及如何调节它们对于确定靶向 RAF 功能的新治疗方法至关重要。在这里,我描述了一种基于生物发光共振能量转移 (BRET) 的测定法,用于测量 CRAF 与活细胞中 14-3-3 蛋白的相互作用。具体来说,该测定法测量了与纳米荧光素酶供体融合的 CRAF 和与 Halo 标签受体融合的 14-3-3 的相互作用,其中 RAF 和 14-3-3 的相互作用导致供体到受体的能量转移和 BRET 信号的产生。该方案进一步表明,该信号可以被显示阻止 14-3-3 与其每个高亲和力 RAF 停靠位点结合的突变破坏。该实验步骤描述了接种、转染和重新铺板细胞的程序,以及读取 BRET 发射、进行数据分析和确认蛋白质表达水平的详细说明。此外,还提供了示例分析结果以及优化和故障排除步骤。
RAF 激酶 (ARAF、BRAF 和 CRAF) 是 RAS GTP 酶的直接效应子,也是促增殖/促存活 RAF-MEK-ERK 激酶级联反应的起始成员。最近的研究表明,CRAF 表达在几种 KRAS 驱动的癌症的肿瘤发生中起关键作用,包括非小细胞肺癌和胰腺导管腺癌 1,2,3,4,5。此外,种系 CRAF 突变会导致一种特别严重的 RASopathy,即 Noonan 综合征 6,7。了解 CRAF 调节对于开发针对其在细胞中的功能的成功治疗方法至关重要。
所有 RAF 激酶均可分为两个功能结构域,即 C 端催化 (CAT) 结构域和 N 端调节 (REG) 结构域,用于控制其活性(图 1A)8。REG 结构域包括 RAS 结合结构域 (RBD)、富含半胱氨酸的结构域 (CRD) 和富含丝氨酸/苏氨酸的区域 (S/T 富集)。值得注意的是,富含 S/T 的区域包含 N’ 位点,该位点以磷酸化依赖性方式与 14-3-3 结合(CRAF 中的 S259;图 1A)8. CAT 结构域包括激酶结构域,以及第二个高亲和力 14-3-3 对接位点,称为 C’ 位点(CRAF 中的 S621;图 1A)8. 二聚体 14-3-3 蛋白与 N’ 和 C’ 位点的差异结合以及 CRD 在 RAF 激活和抑制中起关键作用 9,10,11,12,13。在正常信号转导条件下,RAF 激活是通过 RAS 募集到质膜而启动的,使其能够形成活性二聚体,其中 BRAF-CRAF 异二聚体是主要的活性形式14,15。使用 BRAF 和 CRAF 的生化测定以及二聚体 BRAF 的低温电子显微镜 (Cryo-EM) 结构表明,14-3-3 二聚体通过同时结合两个 RAF 原聚体的 C’ 位点来稳定活性 RAF 二聚体(图 1B)9,13,16,17。相反,研究表明,在静止条件下,RAF 采用胞质性、自抑制确认,其中 REG 结构域与 CAT 结构域结合并抑制其活性 12,18,19,20。这种闭合状态通过与 REG 结构域中的 CRD 和 N’ 位点以及 CAT 结构域中的 C’ 位点结合的 14-3-3 二聚体稳定(图 1B)10,13,21。在 BRAF 中,该模型得到了自体抑制 BRAF 单体的最新冷冻电镜结构以及我们之前的生化研究的支持 10,12,13,21,22。然而,虽然 14-3-3 在 CRAF 调节中起抑制作用23,但类似 BRAF 的自身抑制状态在 CRAF 调节中的作用可能较小12;因此需要进一步的研究来阐明 14-3-3 蛋白调节 CRAF 活性的机制。14-3-3 介导的 RAF 激酶调节需要大量的 RAF 磷酸化和去磷酸化事件、与各种调节蛋白的结合以及与质膜的相互作用8。因此,在生理相关条件下和存在完整脂质双层的情况下测量 14-3-3-RAF 相互作用至关重要。
为了解决这个问题,利用 NanoBRET(以下简称 N-BRET;试剂盒详情见材料表)技术开发了一种基于邻近度的测定法,用于测量 CRAF 与活细胞中 14-3-3 蛋白的相互作用(图 1C)。这种基于 BRET 的系统可测量两种目标蛋白 (POI) 的相互作用,其中一种蛋白质用纳米荧光素酶 (Nano) 供体标记,另一种用 Halo 标签标记,以便用 Halo618 能量受体配体标记22,24。目标蛋白质的相互作用导致供体到受体的能量转移,进而产生 BRET 信号(图 1C)。与传统 BRET 相比,极亮的纳米供体蛋白(发射 (em) 460 nm)和 Halo618 配体 (em 618 nm) 可提供更高的光谱分离和灵敏度,使其成为研究较弱相互作用和检测结合细微变化的理想平台24。事实上,我们之前开发了一种基于 N-BRET 的测定法,用于测量 RAF REG 和 CAT 结构域的自抑制相互作用,这对于表征 BRAF CRD 中的一组 RASopathy 突变至关重要,并证明了该结构域对于维持自身抑制和防止组成型 BRAF 激活的至关重要12。
此处描述的测定法测量与 N 端纳米标签 (Nano-CRAF) 融合的 CRAF 和与 C 端 Halo 标签融合的 14-3-3 的 zeta 亚型(14-3-3ζ-Halo; 图 1C)。我们表明,Nano-CRAF 与 14-3-3ζ-Halo 的相互作用会产生强大的 BRET 信号,该信号反过来又可以被阻止 14-3-3 与 N’ 位点 (S259A) 和/或 C’ 位点 (S621A) 结合的突变破坏。以下方案提供了执行、优化和排除此分析的详细步骤。
先前的研究表明,14-3-3 蛋白在 RAF 激酶的激活和抑制中起关键作用。了解这些结合事件如何被调节以及调节这些相互作用对 RAF 信号转导和 RAF 驱动的肿瘤发生的影响可能会发现针对 CRAF 功能的新治疗脆弱性。然而,Raf 激活周期受到大量相关蛋白、翻译后修饰和亚细胞定位变化的支持8,因此,为了完全概括这些条件,必须在活细胞条件下测量 RAF 与其调节因子的相互作用。该协?…
The authors have nothing to disclose.
该项目部分由美国国立卫生研究院国家癌症研究所的联邦资金资助,项目编号为 ZIA BC 010329。
Antibodies | |||
HaloTag® mouse monoclonal antibody | Promega | G9211 | Antibody for detecting HaloTag tagged proteins by immunoblot |
NanoLuc® mouse monoclonal antibody | R&D Systems | MAB10026 | Antibody for detecting Nano-tagged proteins by immunoblot |
CRAF mouse monoclonal antibody (E10) | Santa Crus Biotechnology | sc-7267 | Antibody directly detecting CRAF proteins by immunoblot |
ECL anti-mouse HRP secondary antibody | Amersham | NA931-1ML | Secondary HRP conjugated mouse antibody (from sheep) |
Reagents | |||
X-tremeGENE™ 9 | Roche/Sigma | 6365809001 | |
NanoBRET™ kit | Promega | N1661 | NanoBRET kit containing Halo 618 ligand and NanoGlo (nanoluciferase) substrate |
DPBS, without Ca++ and Mg++ | Quality Biologicals | 114-057-101 | |
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Life Technologies | 25300120 | |
DMEM cell culture media | Life Technologies | 11995073 | High glucose, L-glutamine, phenol red, sodium pyruvate; without HEPES, suppliment media with 10% FBS, 2 mM L-glutamine and 100U penicillin-streptomycin |
L-Glutamine (200 mM) | Life Technologies | 25030164 | |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Life Technologies | 15140163 | |
Opti-MEM™ I reduced serum media | Gibco | 31985062 | For cell transfection |
Opti-MEM reduced serum media, no phenol red | Gibco | 11058021 | For replating cells on Day 3. Supplement with 2 mM L-glutamine and 100U penicillin-streptomycin, along with 10% FBS (where indicated). |
Invitrogen Trypan Blue Stain | Thermo Scientific | T10282 | |
NP40 lysis buffer | N/A | N/A | 20 mM Tris (pH 8.0), 137mM NaCl, 10% glycerol, NP40 alternative (Milipore, Cat# 492016). Store at 4 degrees C.. Add the following protease and phosphatase immediately prior to use: 20 µM leupeptin, 0.5 mM sodium orthovanidate, 0.15 U/mL, 1mM PMSF. |
5x gel sample buffer | N/A | N/A | 240 mM Tris (pH 8.0), 9.5% SDS, 30% glycerol, 500mM DTT, 3mM bromophenol blue. Store at -20 degrees C. |
Cell lines | |||
293FT cells (human) | Thermo Scientific | R70007 | |
DNA vectors | |||
pCMV5-Nano-CRAF WT and mutant | N/A | N/A | |
pCMV5-14-3-3ζ-Halo | N/A | N/A | |
Equipment | |||
EnVision 2104 Multimode Plate Reader | PerkinElmer 2104 | 2104-0010 | 600LP NanoBRET & M460/50 nm NanoBRET emmisions filters, Luminescence 404 mirror, 6.5 mm measurement height and 0.1 s measurement time |
Invitrogen Countess™ II Automated Cell Counter | Thermo Scientific | AMQAX1000 | |
ThermoFisher E1-ClipTip™ Multichannel Pipettor | Thermo Scientific | 4672070 | |
Software | |||
GraphPad Prism (version 10.0.3) | GraphPad | www.graphpad.com | |
Other | |||
ThermoFisher ClipTip Multichannel pipette tips | Thermo Scientific | 94410153 | |
Reagent Reservoir, 25 mL Divided, Sterile | Thomas Scientific | 1228K16 | |
Perkin Elmer 384-well CulturPlate™ | PerkinElmer | 6007680 | White, polystyrene, tissue culture treated |
Countess Cell Counting Chamber Slides | Thermo Scientific | C10228 |