Dosage basé sur le transfert d’énergie par résonance de bioluminescence (BRET) pour mesurer les interactions de CRAF avec les protéines 14-3-3 dans les cellules vivantes

Les kinases RAF (ARAF, BRAF et CRAF) sont les effecteurs directs des GTPases RAS et les membres initiateurs de la cascade de kinases RAF-MEK-ERK pro-proliférative/pro-survie. Des études récentes ont montré que l’expression de CRAF joue un rôle clé dans la tumorigenèse de plusieurs cancers induits par KRAS, notamment le cancer du poumon non à petites cellules et l’adénocarcinome canalaire pancréatique 1,2,3,4,5. De plus, les mutations germinales de CRAF provoquent une forme particulièrement sévère de la RASopathie, le syndrome de Noonan ^6,7. La compréhension de la régulation de la CRAF est essentielle pour développer des approches thérapeutiques efficaces qui ciblent sa fonction dans les cellules.

Toutes les kinases RAF peuvent être divisées en deux domaines fonctionnels, un domaine catalytique C-terminal (CAT) et un domaine régulateur N-terminal (REG), qui contrôle son activité (Figure 1A)⁸. Le domaine REG englobe le domaine de liaison RAS (RBD), le domaine riche en cystéine (CRD) et une région riche en sérine/thréonine (riche en S/T). Notamment, la région riche en S/T contient le site N’, qui se lie à 14-3-3 de manière dépendante de la phosphorylation (S259 dans CRAF ; Graphique 1A) ⁸. Le domaine CAT englobe le domaine kinase, ainsi qu’un deuxième site d’amarrage 14-3-3 de haute affinité, appelé site C'(S621 en CRAF ; Graphique 1A) ⁸. La liaison différentielle des protéines dimériques 14-3-3 aux sites N’et C’, ainsi que le CRD, jouent un rôle essentiel dans l’activation et l’inhibition de RAF 9,10,11,12,13. Dans des conditions normales de signalisation, l’activation de RAF est initiée par son recrutement dans la membrane plasmique par RAS, ce qui lui permet de former des dimères actifs, dont l’hétérodimère BRAF-CRAF est la forme active prédominante^14,15. Les analyses biochimiques avec BRAF et CRAF, ainsi que les structures de microscopie électronique cryogénique (Cryo-EM) des BRAF dimériques, indiquent qu’un dimère 14-3-3 stabilise les dimères RAF actifs en se liant simultanément au site C’des deux protomères RAF (Figure 1B)9,13,16,17. À l’inverse, des études ont montré que dans des conditions de repos, RAF adopte une confirmation cytosolique, auto-inhibée, où le domaine REG se lie au domaine CAT et inhibe son activité 12,18,19,20. Cet état fermé est stabilisé par un dimère 14-3-3 lié au CRD et au site N’dans le domaine REG et au site C’dans le domaine CAT (Figure 1B)10,13,21. Dans BRAF, ce modèle est soutenu par les structures Cryo-EM récentes de monomères BRAF auto-inhibés et par nos études biochimiques précédentes 10,12,13,21,22. Cependant, alors qu’il est démontré que le 14-3-3 joue un rôle inhibiteur dans la régulation²³ de la CRA, un état auto-inhibé de type BRAF peut jouer un rôle moindre dans la régulation¹² de la CRAC ; par conséquent, d’autres études sont nécessaires pour clarifier les mécanismes par lesquels les protéines 14-3-3 régulent l’activité de CRAF. La régulation des kinases RAF médiée par 14-3-3 nécessite une pléthore d’événements de phosphorylation et de désphosphorylation RAF, la liaison à diverses protéines régulatrices et des interactions avec la membrane plasmique⁸. Par conséquent, il est essentiel que les interactions 14-3-3-RAF soient mesurées dans des conditions physiologiquement pertinentes et en présence d’une bicouche lipidique intacte.

Pour résoudre ce problème, la technologie NanoBRET (ci-après appelée N-BRET ; voir le tableau des matériaux pour les détails du kit) a été utilisée pour développer un test basé sur la proximité permettant de mesurer les interactions de CRAF avec les protéines 14-3-3 dans les cellules vivantes (Figure 1C). Ce système basé sur BRET mesure les interactions de deux protéines d’intérêt (POI), où une protéine est marquée avec un donneur de nanoluciférase (Nano) et l’autre avec un marqueur Halo, pour le marquage avec le ligand accepteur d’énergie Halo618^22,24. L’interaction des protéines d’intérêt entraîne un transfert d’énergie de donneur à accepteur, qui à son tour génère le signal BRET (Figure 1C). La protéine donneuse Nano extrêmement brillante (émission (em) 460 nm) et le ligand Halo618 (em 618 nm) offrent une séparation spectrale et une sensibilité supérieures à celles de BRET conventionnelles, ce qui en fait une plate-forme idéale pour étudier les interactions plus faibles et détecter les changements subtils de liaison²⁴. En effet, nous avons précédemment développé un test basé sur N-BRET pour mesurer les interactions auto-inhibitrices des domaines RAF REG et CAT, ce qui a été essentiel pour la caractérisation d’un panel de mutations RASopathy dans le CRD BRAF et a démontré l’importance critique de ce domaine pour maintenir l’autoinhibition et prévenir l’activation constitutive de BRAF¹².

Le test décrit ici mesure les interactions de CRAF, fusionné à une étiquette Nano N-terminale (Nano-CRAF), et de l’isoforme zêta de 14-3-3 fusionnée à l’étiquette Halo C-terminale (14-3-3ζ-Halo ; Figure 1C). Nous montrons que les interactions de Nano-CRAF avec 14-3-3ζ-Halo génèrent un signal BRET robuste, qui peut à son tour être perturbé par des mutations qui empêchent la liaison de 14-3-3 au site N'(S259A) et/ou au site C'(S621A). Le protocole suivant fournit des étapes détaillées pour effectuer, optimiser et dépanner ce test.