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Imunologia e Infecção

Shigella를 사용한 상피 세포 감염 분석

Published: February 09, 2024
doi:
10.3791/66426
, ,
1Mucosal Immunology and Biology Research Center, Division of Pediatric Gastroenterology and Nutrition,Massachusetts General Hospital, 2Department of Pediatrics,Harvard Medical School

Summary

본 프로토콜은 시험관 내 상피 세포주를 사용하여 Shigella 부착, 침습 및 세포 내 복제를 조사하기 위한 감염 분석을 설명합니다.

Abstract

인간이 적응한 장내 세균 병원균 Shigella는 매년 수백만 건의 감염을 일으키고, 소아 환자들 사이에서 장기적인 성장 효과를 일으키며, 전 세계적으로 설사로 인한 사망의 주요 원인입니다. 감염은 병원체가 위장관을 통과하여 결장 내벽의 상피 세포를 감염시킨 결과로 물이나 피가 섞인 설사를 유발합니다. 항생제 내성이 급격히 증가하고 현재 승인된 백신이 부족하기 때문에 이 무시무시한 병원체를 연구하기 위해서는 표준화된 연구 프로토콜이 매우 중요합니다. 여기에서는 결장 상피 세포에서 박테리아 부착, 침습 및 세포 내 복제에 대한 시험관 내 분석을 사용하여 Shigella의 분자 발병 기전을 조사하는 방법론을 제시합니다. 감염 분석 이전에, Shigella 군집의 독성 표현형은 한천 플레이트에서 콩고 적색 염료의 흡수에 의해 확인되었습니다. 보충된 실험실 배지는 in vivo 조건을 모방하기 위해 박테리아 배양 중에 고려할 수도 있습니다. 그런 다음 박테리아 세포는 표준화된 프로토콜에서 조직 배양 플레이트의 결장 상피 세포를 확립된 다중성 감염에서 감염시키고 각 감염 단계를 분석하기 위한 적응을 통해 사용합니다. 부착 분석의 경우, Shigella 세포는 상피 세포와의 박테리아 접촉을 촉진하기 위해 감소된 배지 수준으로 배양됩니다. 침습 및 세포 내 복제 분석 모두에서 겐타마이신은 세포 외 박테리아를 제거하고 침입 평가 및/또는 세포 내 복제 속도의 정량화를 가능하게 하기 위해 다양한 시간 간격으로 적용됩니다. 모든 감염 프로토콜은 감염된 상피 세포 용해물을 연속적으로 희석하고 콩고 적색 한천 플레이트의 감염 역가와 관련된 박테리아 콜로니 형성 단위를 도금하여 부착, 침입 및/또는 세포 내 박테리아를 열거합니다. 이러한 프로토콜은 상피 세포의 이질균 감염의 각 단계에 대한 독립적인 특성 분석 및 비교를 통해 이 병원체를 성공적으로 연구할 수 있습니다.

Introduction

장내 세균성 병원체로 인한 설사병은 전 세계적으로 심각한 건강 부담입니다. 2016년 설사병은 전 세계적으로 130만 명의 사망을 초래했으며 1,2세 미만 5세 미만 어린이의 사망 원인 중 4위를 차지했습니다. 그람 음성, 장 세균성 병원균 Shigella는 전 세계적으로 설사로 인한 사망의 주요 원인인 이질증의 원인균입니다3. 이질균은 저소득 및 중간소득 국가의 아동에서 매년 상당한 이환율과 사망률을 유발하며4,5 고소득 국가의 감염은 탁아소, 식품 매개 및 수인성 발병과 관련이 있습니다6,7,8,9. 비효율적인 백신 개발10 및 항생제 내성(AMR)11,12 증가로 인해 대규모 이질균 발병 관리가 복잡해졌습니다. 미국 질병통제예방센터(Centers for Disease Control and Prevention)의 최근 자료에 따르면 2020년 미국 내 이질균 감염의 약 46%가 약물 내성을 보였으며13,14 세계보건기구(WHO)는 시겔라를 새로운 치료법이 시급히 필요한 항생제 내성 우선 병원체로 선언했다15.

이질균 감염은 오염된 음식이나 물을 섭취할 때 분변-경구 경로를 통해 또는 직접적인 인체 접촉을 통해 쉽게 전염됩니다. Shigella는 질병을 일으키기에 충분한 10-100개의 박테리아를 가진 효율적이고 인간에 적응한 병원체로 진화했습니다16. 소장 이동 중에 Shigella는 체온 상승 및 담즙과 같은 환경 신호에 노출됩니다17. 이러한 신호의 검출은 인간 결장을 감염시키는 박테리아의 능력을 향상시키는 독성 인자를 발현하기 위해 전사 변화를 유도합니다 17,18,19. Shigella는 정점 표면에서 결장 상피를 침범하지 않고 오히려 소낭 관련 상피20,21,22 내의 특수 항원 제시 마이크로 폴드 세포 (M 세포)로 흡수 된 후 상피 층을 가로 질러 이동합니다. transcytosis에 이어, Shigella 세포는 상주 대식세포에 의해 phagocytosed됩니다. Shigella는 식체를 빠르게 탈출하고 대식세포 세포 사멸을 유발하여 전염증성 사이토카인 5,23,24를 방출합니다. 그런 다음 Shigella는 기저측에서 결장 상피 세포에 침입하여 macropinocytic 액포를 용해시키고 세포질 5,25에 복제 틈새를 설정합니다. 전염증성 사이토카인, 특히 인터루킨-8(IL-8)은 다형핵 호중구 백혈구(PMN)를 감염 부위에 모집하여 상피의 단단한 접합부를 약화시키고 상피 내벽의 박테리아 침투를 가능하게 하여 기저외측 감염을 악화시킨다5. PMN은 감염된 상피 내벽을 파괴하여 감염을 억제하며, 이는 세균성(혈성) 이질의 특징적인 증상을 초래한다5. 침습 및 세포 내 복제 메커니즘이 철저하게 규명되었지만, 새로운 연구는 위장관 (GI) 통과 중 독성 조절17, 순응19, 장벽 투과성을 통한 기저측 접근 개선26 및 영양실조 아동27의 무증상 보균을 포함하여 이질균 감염에 대한 중요한 새로운 개념을 입증하고 있습니다.

설사병을 유발하는 Shigella spp.의 능력은 인간과 비인간 영장류(NHP)로 제한됩니다(NHP)28. Shigella 장 감염 모델은 제브라피시29, 마우스30, 기니피그31, 토끼 21,32,33 및 돼지34,35에 대해 개발되었습니다. 그러나, 이들 모델 시스템 중 어느 것도 인간 감염 중에 관찰된 질병 특성을 정확하게 복제할 수 없다36. 이질균의 NHP 모델은 이질균 발병 기전을 연구하기 위해 확립되었지만, 이러한 모델 시스템은 구현하는 데 비용이 많이 들고 인간의 감염 선량보다 최대 9배나 높은 인위적으로 높은 감염 선량을 필요로 합니다 37,38,39,40,41,42. 따라서 인간 숙주의 감염에 대한 Shigella의 놀라운 적응은 Shigella 발병 기전의 정확한 조사를 위해 생리학적으로 관련된 모델을 재현하기 위해 인간 유래 세포 배양을 사용해야 합니다.

여기에서는 HT-29 결장 상피 세포 내에서 Shigella 부착률, 침습 및 복제율을 측정하기 위한 자세한 절차를 설명합니다. 이러한 표준화된 프로토콜을 사용하여 박테리아 독성 유전자와 환경 신호가 Shigella 감염의 각 단계에 영향을 미치는 분자 메커니즘을 조사하여 동적 숙주-병원체 상호 작용 관계를 더 잘 이해할 수 있습니다.

Protocol

1. 시약 및 재료의 준비 참고: 모든 부피는 두 개의 6웰 플레이트를 사용한 분석과 일치합니다. TSB 배지: 트립틱 대두 육수(TSB, 재료 표 참조) 배지 0.5g에 탈이온수(DI) 15L를 넣고 오토클레이브합니다. 실온에서 보관하십시오. 담즙염 배지(TSB + BS): 0.4%(w/v)의 담즙염을 함유하는 TSB를 제조하기 위해, 0.06g의 담즙염(BS, 재료표 참조…

Representative Results

S. flexneri 2457T 야생형(WT)과 Shigella 독성을 부정적으로 조절하는 것으로 가정된 돌연변이인 S. flexneri ΔVF(ΔVF)를 비교하여 부착, 침습 및 세포 내 복제 분석을 수행했습니다. Shigella는 독성을 조절하기 위한 신호로 담즙염을 사용하기 때문에(17,18,47), TSB 배지 및 0.4%(w/v) 담즙염이 보충된 TSB에서 박테리아 부배양 후 실험을 수행하였다<sup class="…

Discussion

이 프로토콜은 장 상피 세포의 Shigella 부착, 침습 및 세포 내 복제를 연구하기 위한 세 가지 표준화된 분석 세트를 설명합니다. 이러한 방법은 숙주 세포 내에서 다양한 박테리아 병원체의 침입 및 세포 내 복제를 연구하는 데 사용되는 고전적인 겐타마이신 분석법의 수정된 버전일 뿐이지만(49,50,51), Shigella를 연구…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

저자에 대한 지원에는 매사추세츠 종합병원 소아과, 연구 중간 지원 기금 집행 위원회(ISF) 상 2022A009041, 국립 알레르기 및 전염병 연구소 보조금 R21AI146405, 국립 당뇨병 및 소화기 및 신장 질환 연구소 보조금 하버드 영양 비만 연구 센터(NORCH) 2P30DK040561-26이 포함됩니다. 연구비 지원자들은 연구 설계, 자료 수집 및 분석, 출판 결정, 원고 준비에 아무런 역할도 하지 않았다.

Materials

0.22 μm PES filter Millipore-Sigma SCGP00525 Sterile, polyethersulfone filter for sterilizing up to 50 mL media
14 mL culture tubes Corning 352059 17 mm x 100 mm polypropylene test tubes with cap
50 mL conical tubes Corning 430829 50 mL clear polypropylene conical bottom centrifuge tubes with leak-proof cap
6-well tissue culture plates Corning 3516 Plates are treated for optimal cell attachment
Bile salts Sigma-Aldrich B8756 1:1 ratio of cholate to deoxycholate
Congo red dye Sigma-Aldrich C6277 A benzidine-based anionic diazo dye, >85% purity
Countess cell counting chamber slide Invitrogen C10283 To be used with the Countess Automated Cell Counter
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich D8418 A a highly polar organic reagent
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) Gibco 10569-010 DMEM is supplemented with high glucose, sodium pyruvate, GlutaMAX, and Phenol Red
Fetal Bovine Serum (FBS) Sigma-Aldrich F4135 Heat-inactivated, sterile
Gentamicin Sigma-Aldrich G3632 Stock concentration is 50 mg/mL
HT-29 cell line ATCC HTB-38 Adenocarcinoma cell line; colorectal in origin
Paraffin film Bemis PM999 Laboratory sealing film
Petri dishes Thermo Fisher Scientific FB0875713 100 mm x 15 mm Petri dishes for solid media
Phosphate-buffered saline (PBS) Thermo Fisher Scientific 10010049 1x concentration; pH 7.4
Select agar Invitrogen 30391023 A mixture of polysaccharides extracted from red seaweed cell walls to make bacterial plating media
T75 flasks Corning 430641U Tissue culture flasks
Triton X-100 Sigma-Aldrich T8787 A common non-ionic surfactant and emulsifier 
Trypan blue stain Invitrogen T10282 A dye to detect dead tissue culture cells; only live cells can exclude the dye
Trypsin-EDTA Gibco 25200-056 Reagent for cell dissociation for cell line maintenance and passaging
Tryptic Soy Broth (TSB) Sigma-Aldrich T8907 Bacterial growth media
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Referências

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Citar este artigo
Poore, K., Lenneman, B. R., Faherty, C. S. Epithelial Cell Infection Analyses with Shigella. J. Vis. Exp. (204), e66426, doi:10.3791/66426 (2024).
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