Murine Cornea में neurotrophic keratitis और तंत्रिका उत्थान प्रेरित करने के लिए तीन रणनीतियाँ
Summary
यहां, हम कॉर्निया को संक्रमित करने वाले संवेदी तंतुओं को नुकसान पहुंचाने के तीन अलग-अलग तरीकों का प्रस्ताव करते हैं। ये विधियां चूहों में अक्षतंतु पुनर्जनन के अध्ययन की सुविधा प्रदान करती हैं। ये तीन तरीके, जो अन्य पशु मॉडल के अनुकूल हैं, कॉर्नियल संक्रमण शरीर विज्ञान और उत्थान के अध्ययन के लिए आदर्श हैं।
Abstract
कॉर्निया एक पारदर्शी ऊतक है जो आंख को ढकता है और स्पष्ट दृष्टि के लिए महत्वपूर्ण है। यह शरीर में सबसे अधिक संक्रमित ऊतक है। यह संरक्षण आंख को सनसनी और ट्रॉफिक फ़ंक्शन प्रदान करता है और कॉर्नियल अखंडता को संरक्षित करने में योगदान देता है। इस संक्रमण के पैथोलॉजिकल व्यवधान को न्यूरोट्रॉफिक केराटाइटिस कहा जाता है। यह आंख, सर्जरी या बीमारी की चोट से शुरू हो सकता है। इस अध्ययन में, हम उन तरीकों से संक्रमण पर नुकसान पहुंचाने के लिए तीन अलग-अलग प्रोटोकॉल का प्रस्ताव करते हैं जो क्लिनिक में आम तौर पर सामने आने वाले तीन प्रकार के मामलों को पुन: प्राप्त करते हैं।
पहली विधि में एक नेत्र गड़गड़ाहट के साथ उपकला का घर्षण बनाना शामिल है। इसमें उपकला परत, मुक्त तंत्रिका अंत और सबबेसल प्लेक्सस को क्लिनिक में की गई फोटोरिफ्रेक्टिव केराटेक्टोमी सर्जरी के समान तरीके से हटाना शामिल है। दूसरी विधि केवल बायोप्सी पंच के साथ परिधि पर इसे खंडित करके संक्रमण को लक्षित करती है, उपकला की अखंडता को बनाए रखती है। यह विधि लैमेलर केराटोप्लास्टी के पहले चरणों के समान है और केंद्रीय कॉर्निया में अक्षतंतु के पुनर्विकास के बाद संक्रमण के अध: पतन की ओर जाता है। अंतिम विधि एक मल्टीफोटन माइक्रोस्कोप का उपयोग करके एक ट्रांसजेनिक माउस मॉडल के संक्रमण को नुकसान पहुंचाती है, जो विशेष रूप से फ्लोरोसेंट तंत्रिका तंतुओं के cauterization की साइट को स्थानीयकृत करती है। यह विधि फोटोकैराटाइटिस के समान नुकसान पहुंचाती है, यूवी प्रकाश के लिए एक ओवरएक्सपोजर।
यह अध्ययन कॉर्नियल संक्रमण के फिजियोपैथोलॉजी की जांच के लिए विभिन्न विकल्पों का वर्णन करता है, विशेष रूप से अक्षतंतु के अध: पतन और पुनर्जनन। उत्थान को बढ़ावा देना उपकला दोष या यहां तक कि कॉर्निया के छिद्र जैसी जटिलताओं से बचने के लिए महत्वपूर्ण है। प्रस्तावित मॉडल नए औषधीय अणुओं या जीन थेरेपी का परीक्षण करने में मदद कर सकते हैं जो तंत्रिका पुनर्जनन को बढ़ाते हैं और रोग की प्रगति को सीमित करते हैं।
Introduction
कॉर्निया, जो आंख की पारदर्शी सतह है, तीन अलग-अलग परतों से बना है: उपकला, स्ट्रोमा और एंडोथेलियम। इस अंग में शरीर में संक्रमण का घनत्व सबसे अधिक होता है और यह मुख्य रूप से संवेदी तंतुओं (प्रकार Aδ और C) से बना होता है जो ट्राइजेमिनल नाड़ीग्रन्थि की नेत्र शाखा से उत्पन्न होता है। संवेदी फाइबर बड़े बंडलों के रूप में मध्य-स्ट्रोमा में कॉर्निया की परिधि में प्रवेश करते हैं जो सतह को कवर करने के लिए शाखा बनाते हैं। फिर वे बोमन की झिल्ली को छेदने के लिए द्विभाजित होते हैं और सबबेसल प्लेक्सस बनाते हैं, जो कॉर्निया के केंद्र में एक भंवर के गठन से आसानी से पहचानने योग्य होता है। वे तंतु उपकला की बाहरी सतह पर मुक्त तंत्रिका अंत के रूप में समाप्त होते हैं। वे थर्मल, मैकेनिकल और रासायनिक उत्तेजनाओं को ट्रांसड्यूस करने और उपकला होमियोस्टेसिस 1,2 के लिए आवश्यक ट्रॉफिक कारकों को जारी करने में सक्षम हैं। न्यूरोट्रॉफिक केराटाइटिस (एनके) कॉर्नियल संवेदी संक्रमण को प्रभावित करने वाली एक अपक्षयी बीमारी है। यह दुर्लभ बीमारी कॉर्नियल संवेदनशीलता में कमी या हानि से उपजी है जिसके परिणामस्वरूप कम आंसू उत्पादन और कॉर्निया3 के खराब उपचार गुण होते हैं। एनके तीन अच्छी तरह से वर्णित चरणों के माध्यम से प्रगति करता है, चरण 1 से जहां रोगियों को उपकला दोष होते हैं, चरण 3 तक जहां स्ट्रोमल पिघलने और / या कॉर्नियल वेधहोता है 4.
नैदानिक रूप से, इस बीमारी की उत्पत्ति विविध हो सकती है। मरीजों को आंख के लिए शारीरिक चोट के बाद कॉर्नियल संक्रमण खो सकते हैं, सर्जरी, या पुरानी बीमारियों के माध्यम से, मधुमेह 5,6 जैसे. आज तक, एनके रोगजनन प्रक्रिया खराब समझ में आती है, और इस दृष्टि-धमकी की स्थिति के लिए चिकित्सीय विकल्प बहुत सीमित हैं। इसलिए, उन तंतुओं के पुनर्जनन के पीछे तंत्र को बेहतर ढंग से समझने और संभावित रूप से उन्हें बढ़ावा देने के लिए उपकला दोषों की विशेषताओं की बेहतर समझ की आवश्यकता है। यहां, हम कॉर्नियल चोट के कई मॉडल प्रस्तावित करते हैं जो चूहों में एनके को प्रेरित करते हैं।
पहला मॉडल एक ओकुलर गड़गड़ाहट के साथ कॉर्निया की उपकला परत का घर्षण है। इस मॉडल का अध्ययन मुख्य रूप से कृन्तकों और मछली 7,8,9 जैसे विभिन्न जानवरों में उपकला के उत्थान के संदर्भ में किया गया है, और कॉर्नियल हीलिंग10,11को बढ़ावा देने वाले अणुओं का परीक्षण करने के लिए। शारीरिक रूप से, घाव को बंद करने के लिए उपकला कोशिकाओं के लिए 2-3 दिन लगते हैं। संरक्षण के शारीरिक पैटर्न, तथापि, घर्षण12,13 से उबरने के लिए चार सप्ताह से अधिक समय लगता है. सर्जरी के दौरान, ओकुलर गड़गड़ाहट कॉर्निया की उपकला परत को हटा देती है जिसमें सबबेसल प्लेक्सस और फाइबर के मुक्त तंत्रिका अंत होते हैं। आंखों के अपवर्तक दोषों को ठीक करने के लिए फोटोरिफ्रेक्टिव केराटेक्टोमी (पीआरके) वाले रोगियों की तुलना में इस प्रक्रिया की चिकित्सकीय तुलना की जा सकती है। प्रक्रिया में कॉर्निया के उपकला को हटाने और फिर लेजर14 के साथ स्ट्रोमा को फिर से आकार देना शामिल है। मरीजों को इस तरह की सर्जरी के बाद कई साइड इफेक्ट का अनुभव कर सकते हैं, इस तरह के लिए कॉर्नियल तंत्रिका घनत्व की कमी के रूप में 2 साल और की अवधि के लिए संवेदनशीलता में कमी 3 सर्जरी के बाद एक वर्ष के लिए 3 महीने15. यह देखते हुए कि सर्जरी कॉर्नियल माइक्रोएन्वायरमेंट की नाजुकता को प्रेरित करती है, यह मॉडल इन दुष्प्रभावों की जांच करने और चिकित्सीय दृष्टिकोण विकसित करने में मदद कर सकता है जो तेजी से पुनर्जन्म को बढ़ावा देगा, इस प्रकार प्रश्न में दुष्प्रभावों को कम करेगा।
दूसरे मॉडल में बायोप्सी पंच के साथ कॉर्निया की परिधि पर अक्षतंतु को विभाजित करना शामिल है, जो केंद्रीय संक्रमण 16 के वालेरियन अध: पतन को प्रेरित करता है। नैदानिक रूप से, इस विधि पूर्वकाल लैमेलर keratoplasty की तुलना में किया जा सकता है, जिसमें सर्जन कॉर्निया के पूर्वकाल मोटाई का एक हिस्सा को दूर करने और एक दाता प्रत्यारोपण 17 के साथ यह बदलने के लिए कॉर्निया के एक आंशिक trephination का एहसास है. लैमेलर केराटोप्लास्टी के बाद, रोगियों को सूखी आंख, कॉर्नियल संरक्षण और भ्रष्टाचार अस्वीकृति18 की हानि सहित लक्षणों की एक संख्या से पीड़ित हो सकता है. कॉर्नियल नसों पर किया गया यह एक्सोटॉमी मॉडल फाइबर अपघटन के तंत्र में अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकता है, जो एक ग्राफ्ट के बाद होता है, इसके बाद अक्षतंतु का उत्थान होता है।
तीसरी विधि एक लेजर के साथ कॉर्नियल नसों को नुकसान पहुंचाती है। संवेदनाहारी जानवरों के कॉर्निया पर एक multiphoton माइक्रोस्कोप का उपयोग करके, ऑप्टिकल क्षेत्र में स्थानीयकृत नसों के अध: पतन प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (आरओएस) गठन का एक परिणाम के रूप में प्रेरित है, जो डीएनए क्षति और सेलुलर गुहिकायन19 की ओर जाता है. इस विधि भी आरओएस गठन से चलाता है, जो प्राकृतिक यूवी (सनबर्न) के लिए overexposure द्वारा प्रेरित कॉर्नियल photodamage recapitulates, डीएनए क्षति20 के लिए अग्रणी. कॉर्नियल सनबर्न से पीड़ित मरीजों को बहुत दर्द होता है, क्योंकि उपकला कोशिकाओं की गिरावट कॉर्नियल फाइबर के चरम सीमाओं को वंचित करती है।
यहां वर्णित तीन विधियों को एनके रोगजनन प्रक्रिया और अक्षतंतु पुनर्जनन की जांच को सक्षम करने के लिए डिज़ाइन किया गया है। वे आसानी से प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य और सटीक हैं। इसके अलावा, वे जानवरों की त्वरित वसूली और आसान निगरानी की अनुमति देते हैं।
Protocol
Representative Results
Discussion
न्यूरोट्रॉफिक केराटाइटिस को एक दुर्लभ बीमारी माना जाता है, जो 10,000 व्यक्तियों में से 5 को प्रभावित करता है। हालांकि, रासायनिक जलने जैसे शारीरिक चोट के कारण एनके से पीड़ित लोग, या मधुमेह या मल्टीपल स्केले?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखक ट्रांसजेनिक माउस लाइन मैजिक-मार्कर्स तक पहुंच के लिए डॉ. काराइन लौलियर को धन्यवाद देते हैं। लेखक रैम-न्यूरो पशु कोर सुविधा और इमेजिंग सुविधा एमआरआई का भी धन्यवाद करते हैं, जो फ्रांसीसी राष्ट्रीय अनुसंधान एजेंसी (ANR-10-INBS-04, “भविष्य के लिए निवेश”) द्वारा समर्थित फ्रांस-बायोइमेजिंग राष्ट्रीय बुनियादी ढांचे का सदस्य है। इस शोध को ATIP-Avenir कार्यक्रम, Inserm, Région Occitanie, मोंटपेलियर विश्वविद्यालय, फ्रेंच नेशनल रिसर्च एजेंसी (ANR-21-CE17-0061), Fondation pour la Recherche Médicale (FRM पुनर्योजी चिकित्सा, REP202110014140), और Groupama फाउंडेशन द्वारा समर्थित किया गया था।
Materials
| 0.2 µm seringe filter | CLEARLINE | 51733 | |
| 0.5 mm rust ring remover | Alger Equipment Company | BU-5S | |
| 2 mL plastic tubes | Eppendrof | 30120094 | |
| Algerbrush burr, Complete instrument | Alger Equipment Company | BR2-5 | |
| Anti-beta III Tubulin antibody | Abcam | ab18207 | |
| Antigenfix | Diapath | P0016 | |
| Artificial tear | Larmes artificielles Martinet | N/A | |
| Buprecare | Animalcare | N/A | |
| Cotton swab | Any provider | N/A | |
| Dissecting tools | Fine Science Tools | N/A | |
| Fluorescein | Merck | 103887 | |
| Gelatin from cold water fish skin | Sigma | G7765 | |
| Goat serum | Merck | S26 | |
| Head Holder | Narishige | SGM 4 | |
| Heated plate | BIOSEB LAB instruments | BIO-HE002 | |
| Hoechst 33342 | Thermo Fisher Scientific | H3570 | |
| Imalgene 1000 | BOEHRINGER INGELHEIM ANIMAL HEALTH France | N/A | French marketing authorization numbre: FR/V/0167433 4/1992 |
| LAS X software | Leica | N/A | Large volume computational clearing (LVCC) process |
| Laser Chameleon Ultra II | Coherent | N/A | |
| Laser power meter | Coherent | N/A | |
| Leica Thunder Imager Tissue microscope | Leica | N/A | |
| Multi-photon Zeiss LSM 7MP upright microscope | Zeiss | N/A | |
| Ocry-gel | TVM lab | N/A | |
| Parametric oscillator | Coherent | N/A | |
| Penlights with blue cobalt filtercap | Bernell | ALPEN | |
| Petri dish | Thermo Scientific | 150318 | Axotomy protocol |
| Petridish | Thermo Scientific | 150288 | Cornea whole-mount processing |
| Rompun 2% | Elanco | N/A | French marketing authorization numbre: FR/V/8146715 2/1980 |
| Sterile biopsy punch 2.5 mm | LCH medical | LCH-PUK-25 | |
| Triton X-100 | VWR | 0694 | |
| Vectashield | EuroBioSciences | H-1000 | Mounting medium |
Referências
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