Tillämpningen av stödskikt på kryogena elektronmikroskopinät (cryoEM) kan öka partikeltätheten, begränsa interaktioner med luft-vattengränssnittet, minska strålinducerad rörelse och förbättra fördelningen av partikelorienteringar. Denna artikel beskriver ett robust protokoll för att belägga kryoEM-rutnät med ett monolager av grafen för förbättrad kryoprovberedning.
I kryogen elektronmikroskopi (cryoEM) appliceras renade makromolekyler på ett rutnät med en hålig kolfolie; Molekylerna torkas sedan för att avlägsna överflödig vätska och fryses snabbt i ett cirka 20-100 nm tjockt lager av glasaktig is, upphängd i cirka 1 μm breda foliehål. Det resulterande provet avbildas med kryogen transmissionselektronmikroskopi, och efter bildbehandling med lämplig programvara kan strukturer med nära atomär upplösning bestämmas. Trots cryoEM:s utbredda användning är provberedning fortfarande en allvarlig flaskhals i cryoEM-arbetsflöden, med användare som ofta stöter på utmaningar relaterade till prover som beter sig dåligt i den suspenderade glasisen. Nyligen har metoder utvecklats för att modifiera kryoEM-rutnät med ett enda kontinuerligt lager av grafen, som fungerar som en stödyta som ofta ökar partikeldensiteten i det avbildade området och kan minska interaktioner mellan partiklar och gränsytan mellan luft och vatten. Här tillhandahåller vi detaljerade protokoll för applicering av grafen på kryoEM-nät och för att snabbt bedöma den relativa hydrofiliciteten hos de resulterande gallren. Dessutom beskriver vi en EM-baserad metod för att bekräfta närvaron av grafen genom att visualisera dess karakteristiska diffraktionsmönster. Slutligen demonstrerar vi användbarheten av dessa grafenbärare genom att snabbt rekonstruera en 2,7 Å upplösningstäthetskarta av ett Cas9-komplex med hjälp av ett rent prov vid en relativt låg koncentration.
Kryogen elektronmikroskopi (cryoEM) har utvecklats till en allmänt använd metod för att visualisera biologiska makromolekyler1. Med hjälp av framsteg inom direkt elektrondetektion 2,3,4, datainsamling5 och bildbehandlingsalgoritmer 6,7,8,9,10 kan cryoEM nu producera 3D-strukturer med nära atomär upplösning av ett snabbt växande antal makromolekyler11. Dessutom, genom att utnyttja metodens enmolekylkaraktär, kan användare bestämma flera strukturer från ett enda prov 12,13,14,15, vilket belyser löftet om att använda de data som genereras för att förstå heterogena strukturella ensembler16,17. Trots dessa framsteg kvarstår flaskhalsar i beredningen av kryoprover.
För strukturell karakterisering med kryoEM bör biologiska prover vara väl dispergerade i vattenlösning och sedan snabbfrysas genom en process som kallas vitrifikation 18,19. Målet är att fånga partiklar i ett jämnt tunt lager av förglasad is som är upphängd i regelbundet åtskilda hål som vanligtvis skärs i ett lager av amorft kol. Denna mönstrade amorfa kolfolie stöds av ett TEM-galler med ett nät av koppar- eller guldstödstänger. I standardarbetsflöden görs rutnät hydrofila med hjälp av en plasmabehandling med glödurladdning före applicering av provet. Överskottsvätska torkas med filterpapper, vilket gör att proteinlösningen kan bilda en tunn flytande film över hålen som lätt kan förglasas under djupfrysning. Vanliga utmaningar inkluderar partikellokalisering till luft-vattengränssnittet (AWI) och efterföljande denaturering20,21,22 eller antagande av föredragna orienteringar 23,24,25, partikelvidhäftning till kolfolien snarare än att migrera in i hålen, och kluster och aggregering av partiklarna i hålen26. Ojämn istjocklek är ett annat problem; Tjock is kan resultera i högre nivåer av bakgrundsbrus i mikrograferna på grund av ökad elektronspridning, medan extremt tunn is kan utesluta större partiklar27.
För att ta itu med dessa utmaningar har en mängd olika tunna stödfilmer använts för att belägga gallerytor, vilket gör att partiklar kan vila på dessa stöd och helst undvika interaktioner med luft-vattengränssnittet. Grafenstöd har visat sig mycket lovande, delvis på grund av deras höga mekaniska hållfasthet i kombination med deras minimala spridningstvärsnitt, vilket minskar bakgrundssignalen som tillförs av stödskiktet28. Förutom sitt minimala bidrag till bakgrundsbrus uppvisar grafen också en anmärkningsvärd elektrisk och termisk ledningsförmåga29. Grafen och grafenoxidbelagda rutnät har visat sig ge högre partikeldensitet, mer enhetlig partikelfördelning30 och minskad lokalisering till AWI22. Dessutom ger grafen en stödyta som kan modifieras ytterligare för att: 1) finjustera rutnätsytans fysiokemiska egenskaper genom funktionalisering 31,32,33; eller 2) kopplingsmedel som underlättar affinitetsrening av proteiner av intresse 34,35,36.
I den här artikeln har vi modifierat en befintlig procedur för att belägga cryoEM-rutnät med ett enda enhetligt lager av grafen30. Ändringarna syftar till att minimera näthanteringen genom hela protokollet, med målet att öka avkastningen och reproducerbarheten. Dessutom diskuterar vi vårt tillvägagångssätt för att utvärdera effektiviteten av olika UV/ozonbehandlingar för att göra rutnät hydrofila före nedsänkning. Detta steg i kryoEM-provberedning med grafenbelagda rutnät är kritiskt, och vi har funnit att vår enkla metod för att kvantifiera den relativa hydrofiliciteten hos de resulterande rutnäten är användbar. Med hjälp av detta protokoll demonstrerar vi nyttan av att använda grafenbelagda rutnät för strukturbestämning genom att generera en högupplöst 3D-rekonstruktion av katalytiskt inaktiva S. pyogenes Cas9 i komplex med guide-RNA och mål-DNA.
CryoEM-provberedning innebär en mängd tekniska utmaningar, där de flesta arbetsflöden kräver att forskare manuellt manipulerar ömtåliga galler med extrem försiktighet för att undvika att skada dem. Dessutom är det oförutsägbart att ett prov kan förglasas. Partiklar interagerar ofta med gränsytan mellan luft och vatten eller med den fasta stödfolie som täcker gallren, vilket kan leda till att partiklar antar föredragna riktningar eller inte kommer in i avbildningshålen om inte mycket höga proteinkoncent…
The authors have nothing to disclose.
Prover förbereddes och avbildades vid CryoEM-anläggningen i MIT.nano på mikroskop som förvärvats tack vare Arnold och Mabel Beckmans stiftelse. Kontaktvinkelavbildningsenheter skrevs ut på MIT Metropolis Maker Space. Vi tackar Nieng Yans och Yimo Hans laboratorier och personalen på MIT.nano för deras stöd under införandet av denna metod. Vi vill särskilt tacka doktorerna Guanhui Gao och Sarah Sterling för deras insiktsfulla diskussioner och feedback. Detta arbete stöddes av NIH-anslagen R01-GM144542, 5T32-GM007287 och NSF-CAREER-anslaget 2046778. Forskningen i Davis-laboratoriet stöds av Alfred P. Sloan Foundation, James H. Ferry Fund, MIT J-Clinic och Whitehead Family.
250 mL beaker (3x) | Fisher | 02-555-25B | |
50 mL beaker (2x) | Corning | 1000-50 | |
Acetone | Fisher | A949-4 | |
Aluminum foil | Fisher | 15-078-292 | |
Ammonium persulfate | Fisher | (I17874 | |
Coverslips 50 mm x 24 mm | Mattek | PCS-1.5-5024 | |
CVD graphene | Graphene Supermarket | CVD-Cu-2×2 | |
easiGlow discharger | Ted-Pella | 91000S | |
Ethanol | Millipore-Sigma | 1.11727 | |
Flat-tip tweezers | Fisher | 50-239-60 | |
Glass cutter | Grainger | 21UE26 | |
Glass petri plate and cover | VWR | 75845-544 | |
Glass serological pipette | Fisher | 13-676-34D | |
Grid Storage Case | EMS | 71146-02 | |
Hot plate | Fisher | 07-770-108 | |
Isopropanol | Sigma | W292907 | |
Kimwipe | Fisher | 06-666 | |
Lab scissors | Fisher | 13-806-2 | |
Methyl-Methacrylate EL-6 | Kayaku | MMA M310006 0500L1GL | |
Molecular grade water | Corning | 46-000-CM | |
Negative action tweezers (2x) | Fisher | 50-242-78 | |
P20 pipette | Rainin | 17014392 | |
P200 pipette | Rainin | 17008652 | |
Parafilm | Fisher | 13-374-12 | |
Pipette tips | Rainin | 30389291 | |
Quantifoil grids with holey carbon | EMS | Q2100CR1 | |
Spin coater | SetCas | KW-4A | with chuck SCA-19-23 |
Straightedge | ULINE | H-6560 | |
Thermometer | Grainger | 3LRD1 | |
UV/Ozone cleaner | BioForce | SKU: PC440 | |
Vacuum desiccator | Thomas Scientific | 1159X11 | |
Whatman paper | VWR | 28297-216 |