Криогенная электронная микроскопия одиночных частиц (криоЭМ) превратилась в широко используемый метод визуализации биологических макромолекул¹. Благодаря достижениям в области прямого обнаружения электронов ^2,3,4, сбора данных⁵ и алгоритмов обработки изображений ^6,7,8,9,10, cryoEM теперь способна создавать 3D-структуры с близким к атомному разрешением быстро растущего числа макромолекул ¹¹. Кроме того, используя одномолекулярную природу подхода, пользователи могут определить несколько структур из одного образца 12,13,14,15, что подчеркивает перспективность использования полученных данных для понимания гетерогенных структурных ансамблей ^16,17. Несмотря на этот прогресс, сохраняются узкие места в подготовке сетки для криообразцов.

Для структурной характеристики с помощью криоЭМ биологические образцы должны быть хорошо диспергированы в водном растворе, а затем подвергнуты мгновенной заморозке с помощью процесса, называемого витрификацией^18,19. Цель состоит в том, чтобы улавливать частицы в равномерно тонком слое стекловидного льда, взвешенного в равномерно расположенных отверстиях, которые, как правило, вырезаны в слое аморфного углерода. Эта узорчатая аморфная углеродная фольга поддерживается сеткой TEM, несущей сетку из медных или золотых опорных стержней. В стандартных рабочих процессах решетки становятся гидрофильными с помощью плазменной обработки тлеющим разрядом перед нанесением образца. Излишки жидкости промокают фильтровальной бумагой, что позволяет белковому раствору образовывать тонкую жидкую пленку через отверстия, которую можно легко остекловыть во время погружной заморозки. Общие проблемы включают локализацию частиц на границе раздела воздух-вода (AWI) и последующую денатурацию 20,21,22 или принятие предпочтительных ориентаций 23,24,25, прилипание частиц к углеродной фольге вместо того, чтобы мигрировать в отверстия, а также кластеризацию и агрегацию частиц в отверстиях²⁶. Еще одной проблемой является неоднородная толщина льда; Толстый лед может привести к более высокому уровню фонового шума на микрофотографиях из-за повышенного рассеяния электронов, в то время как чрезвычайно тонкий лед может исключать более крупные частицы²⁷.

Для решения этих проблем были использованы различные тонкие опорные пленки для покрытия поверхностей сетки, что позволяет частицам оставаться на этих опорах и, в идеале, избегать взаимодействия с границей раздела воздух-вода. Графеновые опоры показали большие перспективы, отчасти из-за их высокой механической прочности в сочетании с минимальным сечением рассеяния, что снижает фоновый сигнал, добавляемый опорным слоем²⁸. В дополнение к своему минимальному вкладу в фоновый шум, графен также демонстрирует замечательную электро- и теплопроводность²⁹. Было показано, что сетки с покрытием из графена и оксида графена обеспечивают более высокую плотность частиц, более равномерное распределение частиц³⁰ и меньшую локализацию к AWI²². Кроме того, графен обеспечивает опорную поверхность, которая может быть дополнительно модифицирована для: 1) настройки физико-химических свойств поверхности сетки посредством функционализации 31,32,33; или 2) парные связывающие агенты, облегчающие аффинную очистку интересующих белков 34,35,36.

В данной статье мы модифицировали существующую процедуру покрытия криоЭМ-сеток одним однородным слоем графена³⁰. Изменения направлены на минимизацию обработки сетки во всем протоколе с целью повышения производительности и воспроизводимости. Кроме того, мы обсуждаем наш подход к оценке эффективности различных УФ/озоновых обработок для придания решеткам гидрофильности перед погружением. Этот этап подготовки криоЭМ образцов с использованием сеток с графеновым покрытием имеет решающее значение, и мы обнаружили, что наш простой метод количественной оценки относительной гидрофильности полученных сеток является полезным. Используя этот протокол, мы демонстрируем полезность использования сеток с графеновым покрытием для определения структуры путем создания 3D-реконструкции с высоким разрешением каталитически неактивного S. pyogenes Cas9 в комплексе с направляющей РНК и ДНК-мишенью.