Enkeltpartikkelkryogen elektronmikroskopi (cryoEM) har utviklet seg til en mye brukt metode for visualisering av biologiske makromolekyler¹. Drevet av fremskritt innen direkte elektrondeteksjon ^2,3,4, datainnsamling⁵ og bildebehandlingsalgoritmer ^6,7,8,9,10, er cryoEM nå i stand til å produsere 3D-strukturer med nær atomoppløsning av et raskt voksende antall makromolekyler¹¹. Videre, ved å utnytte tilnærmingens enkeltmolekylære natur, kan brukerne bestemme flere strukturer fra en enkelt prøve 12,13,14,15, og fremheve løftet om å bruke dataene som genereres for å forstå heterogene strukturelle ensembler ^16,17. Til tross for denne fremgangen fortsetter flaskehalser i klargjøring av kryoprøver.

For strukturell karakterisering ved kryoEM, bør biologiske prøver være godt dispergert i vandig løsning og må deretter flashfryses gjennom en prosess som kalles vitrifisering ^18,19. Målet er å fange partikler i et jevnt tynt lag av forglasset is suspendert over regelmessig fordelte hull som vanligvis kuttes i et lag av amorft karbon. Denne mønstrede amorfe karbonfolien støttes av et TEM-gitter som bærer et nett av kobber- eller gullstøttestenger. I standard arbeidsflyter gjengis rister hydrofile ved hjelp av en plasmabehandling med glødeutladning før prøven påføres. Overflødig væske blottes med filterpapir, slik at proteinløsningen danner en tynn væskefilm over hullene som lett kan vitrifiseres under frysing av lunger. Vanlige utfordringer inkluderer partikkellokalisering til luft-vanngrensesnittet (AWI) og påfølgende denaturering^20,21,22 eller adopsjon av foretrukne orienteringer 23,24,25, partikkeladherens til karbonfolien i stedet for å migrere inn i hullene, og klynging og aggregering av partiklene i hullene²⁶. Ujevn istykkelse er en annen bekymring; Tykk is kan gi høyere bakgrunnsstøy i mikrografene på grunn av økt elektronspredning, mens ekstremt tynn is kan utelukke større partikler²⁷.

For å møte disse utfordringene har en rekke tynne støttefilmer blitt brukt til å belegge gitteroverflater, slik at partikler kan hvile på disse støttene og, ideelt sett, unngå interaksjoner med luft-vanngrensesnittet. Grafenstøtter har vist stort løfte, delvis på grunn av deres høye mekaniske styrke kombinert med deres minimale spredningstverrsnitt, noe som reduserer bakgrunnssignalet lagt til av støttelaget²⁸. I tillegg til det minimale bidraget til bakgrunnsstøy, viser grafen også bemerkelsesverdig elektrisk og termisk ledningsevne²⁹. Grafen og grafenoksydbelagte nett har vist seg å gi høyere partikkeltetthet, mer jevn partikkelfordeling³⁰ og redusert lokalisering til AWI²². I tillegg gir grafen en støtteflate som kan modifiseres ytterligere til: 1) justere de fysiokjemiske egenskapene til gitteroverflaten gjennom funksjonalisering 31,32,33; eller 2) parkoblingsmidler som letter affinitetsrensing av proteiner av interesse 34,35,36.

I denne artikkelen har vi endret en eksisterende prosedyre for å belegge cryoEM-gitter med et enkelt jevnt lag grafen³⁰. Modifikasjonene tar sikte på å minimere netthåndtering gjennom hele protokollen, med mål om å øke utbyttet og reproduserbarheten. I tillegg diskuterer vi vår tilnærming for å evaluere effekten av ulike UV/ozon-behandlinger ved å gjøre ristene hydrofile før de stuper. Dette trinnet i klargjøring av kryoEM-prøver ved bruk av grafenbelagte rutenett er kritisk, og vi har funnet ut at vår enkle metode for å kvantifisere den relative hydrofiliteten til de resulterende rutene er nyttig. Ved hjelp av denne protokollen demonstrerer vi nytten av å bruke grafenbelagte nett for strukturbestemmelse ved å generere en høyoppløselig 3D-rekonstruksjon av katalytisk inaktive S. pyogenes Cas9 i kompleks med guide RNA og mål-DNA.