고분해능 구조 측정을 위해 Monolayer Graphene을 Cryo-Electron Microscopy Grid에 적용
Summary
극저온 전자 현미경(cryoEM) 그리드에 지지층을 적용하면 입자 밀도를 높이고, 공기-물 계면과의 상호 작용을 제한하고, 빔 유도 동작을 줄이고, 입자 배향 분포를 개선할 수 있습니다. 이 백서에서는 cryoEM 그리드를 그래핀 단층으로 코팅하여 cryo-sample 전처리를 개선하기 위한 강력한 프로토콜에 대해 설명합니다.
Abstract
극저온 전자 현미경(cryoEM)에서 정제된 거대분자는 구멍이 있는 탄소박이 있는 그리드에 적용됩니다. 그런 다음 분자를 블롯트하여 과도한 액체를 제거하고 약 20-100nm 두께의 유리질 얼음 층에서 약 1μm 너비의 호일 구멍에 부유하여 빠르게 동결합니다. 결과 샘플은 극저온 투과 전자 현미경을 사용하여 이미지화되고 적절한 소프트웨어를 사용하여 이미지 처리 후 거의 원자 분해능 구조를 결정할 수 있습니다. CryoEM이 널리 채택되었음에도 불구하고 시료 전처리는 CryoEM 워크플로우에서 여전히 심각한 병목 현상을 겪고 있으며, 사용자는 부유 유리체 얼음에서 시료가 제대로 작동하지 않는 것과 관련된 문제에 자주 직면합니다. 최근에는 그래핀의 단일 연속 층으로 CryoEM 그리드를 수정하는 방법이 개발되었으며, 그래핀은 종종 이미징 영역의 입자 밀도를 증가시키고 입자와 공기-물 계면 간의 상호 작용을 줄일 수 있는 지지 표면 역할을 합니다. 여기에서는 CryoEM 그리드에 그래핀을 적용하고 결과 그리드의 상대적 친수성을 신속하게 평가하기 위한 자세한 프로토콜을 제공합니다. 또한 특징적인 회절 패턴을 시각화하여 그래핀의 존재를 확인하는 EM 기반 방법을 설명합니다. 마지막으로, 상대적으로 낮은 농도의 순수 샘플을 사용하여 Cas9 복합체의 2.7 Å 분해능 밀도 맵을 신속하게 재구성하여 이러한 그래핀 지지체의 유용성을 입증합니다.
Introduction
단일 입자 극저온 전자 현미경(cryoEM)은 생물학적 거대분자를 시각화하는 데 널리 사용되는 방법으로 발전했습니다1. 직접 전자 검출 2,3,4, 데이터 수집5 및 이미지 처리 알고리즘 6,7,8,9,10의 발전에 힘입어 CryoEM은 이제 빠르게 증가하는 거대분자11의 원자 분해능에 가까운 3D 구조를 생성할 수 있습니다. 더욱이, 접근법의 단일 분자 특성을 활용함으로써, 사용자는 단일 샘플 12,13,14,15로부터 여러 구조를 결정할 수 있으며, 이는 이종 구조 앙상블을 이해하기 위해 생성된 데이터를 사용할 수 있는 가능성을 강조합니다(16,17). 이러한 진전에도 불구하고 극저온 시료 그리드 준비의 병목 현상은 지속되고 있습니다.
CryoEM에 의한 구조적 특성 분석을 위해 생물학적 시료는 수용액에 잘 분산된 다음 유리화18,19라는 공정을 통해 급속 동결되어야 합니다. 목표는 일반적으로 비정질 탄소 층으로 절단되는 규칙적인 간격의 구멍에 부유하는 유리화된 얼음의 균일하게 얇은 층에서 입자를 포착하는 것입니다. 이 패턴이 있는 비정질 탄소 호일은 구리 또는 금 지지대 메쉬가 있는 TEM 그리드에 의해 지지됩니다. 표준 워크플로우에서 그리드는 시료를 적용하기 전에 글로우 방전 플라즈마 처리를 사용하여 친수성으로 렌더링됩니다. 과도한 액체는 여과지로 블링되어 단백질 용액이 플런지 동결 중에 쉽게 유리화될 수 있는 구멍을 가로질러 얇은 액체 막을 형성할 수 있습니다. 일반적인 과제는 공기-물 계면(AWI)에 대한 입자 국소화 및 후속 변성(20,21,22) 또는 바람직한 방향(23,24,25)의 채택, 구멍으로 이동하지 않고 탄소박에 입자가 부착되는 것, 구멍(26) 내의 입자의 클러스터링 및 응집을 포함한다 . 불균일한 얼음 두께는 또 다른 문제입니다. 두꺼운 얼음은 전자 산란의 증가로 인해 현미경 사진에서 더 높은 수준의 배경 잡음을 초래할 수 있는 반면, 극도로 얇은 얼음은 더 큰 입자를 배제할 수 있다27.
이러한 문제를 해결하기 위해 다양한 박막 지지 필름을 사용하여 그리드 표면을 코팅하여 입자가 이러한 지지체에 놓일 수 있도록 하고 이상적으로는 공기-물 계면과의 상호 작용을 피할 수 있습니다. 그래핀 지지체는 부분적으로는 지지층(28)에 의해 추가되는 배경 신호를 감소시키는 그들의 최소 산란 단면과 결합된 높은 기계적 강도 때문에 큰 가능성을 보여주었다. 배경 잡음에 대한 기여를 최소화하는 것 외에도, 그래핀은 또한 현저한 전기 및 열 전도성을 나타낸다29. 그래핀 및 그래핀 산화물 코팅 그리드는 더 높은 입자 밀도, 더 균일한 입자 분포(30) 및 AWI22에 대한 국소화 감소를 생성하는 것으로 나타났습니다. 또한, 그래핀은 다음과 같이 추가로 변형될 수 있는 지지면을 제공한다: 1) 기능화(31,32,33)를 통해 격자 표면의 물리화학적 특성을 조정하고; 또는 2) 관심 단백질의 친화성 정제를 촉진하는 커플 연결제 34,35,36.
이 기사에서는 CryoEM 그리드를 그래핀30의 단일 균일한 층으로 코팅하는 기존 절차를 수정했습니다. 이러한 수정은 수율과 재현성을 높이는 것을 목표로 프로토콜 전반에 걸쳐 그리드 처리를 최소화하는 것을 목표로 합니다. 또한 플런지 전에 그리드를 친수성으로 렌더링하는 다양한 UV/오존 처리의 효능을 평가하기 위한 접근 방식에 대해 논의합니다. 그래핀 코팅 그리드를 사용한 CryoEM 시료 전처리의 이 단계는 매우 중요하며, 결과 그리드의 상대적 친수성을 정량화하는 간단한 방법이 유용하다는 것을 알게 되었습니다. 이 프로토콜을 사용하여 가이드 RNA 및 표적 DNA와 복합체에서 촉매적으로 비활성 S. pyogenes Cas9의 고해상도 3D 재구성을 생성하여 구조 결정을 위해 그래핀 코팅 그리드를 사용하는 유용성을 입증합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
CryoEM 시료 전처리에는 여러 가지 기술적 문제가 수반되며, 대부분의 워크플로우에서는 연구원이 손상을 방지하기 위해 극도로 주의를 기울여 깨지기 쉬운 그리드를 수동으로 조작해야 합니다. 또한 유리화에 대한 모든 샘플의 적합성은 예측할 수 없습니다. 입자는 종종 공기-물-계면 또는 그리드를 덮고 있는 고체 지지 포일과 상호 작용하며, 이는 매우 높은 단백질 농도가 적용되지 않는 한 입자…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
표본은 MIT.nano의 CryoEM 시설에서 Arnold and Mabel Beckman Foundation 덕분에 획득한 현미경으로 준비되고 이미지화되었습니다. 접촉각 이미징 장치는 MIT Metropolis Maker Space에서 인쇄되었습니다. 우리는 Nieng Yan과 Yimo Han의 실험실, 그리고 이 방법의 채택을 통하여 그들의 지원을 위한 MIT.nano에 직원에게 감사한다. 특히 통찰력 있는 토론과 피드백을 주신 Guanhui Gao 박사와 Sarah Sterling 박사님께 감사드립니다. 이 연구는 NIH 보조금 R01-GM144542, 5T32-GM007287 및 NSF-CAREER 보조금 2046778의 지원을 받았습니다. 데이비스 연구실의 연구는 알프레드 P. 슬론 재단(Alfred P. Sloan Foundation), 제임스 H. 페리 기금(James H. Ferry Fund), MIT J-클리닉(MIT J-Clinic) 및 화이트헤드 가족(Whitehead Family)의 지원을 받고 있습니다.
Materials
| 250 mL beaker (3x) | Fisher | 02-555-25B | |
| 50 mL beaker (2x) | Corning | 1000-50 | |
| Acetone | Fisher | A949-4 | |
| Aluminum foil | Fisher | 15-078-292 | |
| Ammonium persulfate | Fisher | (I17874 | |
| Coverslips 50 mm x 24 mm | Mattek | PCS-1.5-5024 | |
| CVD graphene | Graphene Supermarket | CVD-Cu-2×2 | |
| easiGlow discharger | Ted-Pella | 91000S | |
| Ethanol | Millipore-Sigma | 1.11727 | |
| Flat-tip tweezers | Fisher | 50-239-60 | |
| Glass cutter | Grainger | 21UE26 | |
| Glass petri plate and cover | VWR | 75845-544 | |
| Glass serological pipette | Fisher | 13-676-34D | |
| Grid Storage Case | EMS | 71146-02 | |
| Hot plate | Fisher | 07-770-108 | |
| Isopropanol | Sigma | W292907 | |
| Kimwipe | Fisher | 06-666 | |
| Lab scissors | Fisher | 13-806-2 | |
| Methyl-Methacrylate EL-6 | Kayaku | MMA M310006 0500L1GL | |
| Molecular grade water | Corning | 46-000-CM | |
| Negative action tweezers (2x) | Fisher | 50-242-78 | |
| P20 pipette | Rainin | 17014392 | |
| P200 pipette | Rainin | 17008652 | |
| Parafilm | Fisher | 13-374-12 | |
| Pipette tips | Rainin | 30389291 | |
| Quantifoil grids with holey carbon | EMS | Q2100CR1 | |
| Spin coater | SetCas | KW-4A | with chuck SCA-19-23 |
| Straightedge | ULINE | H-6560 | |
| Thermometer | Grainger | 3LRD1 | |
| UV/Ozone cleaner | BioForce | SKU: PC440 | |
| Vacuum desiccator | Thomas Scientific | 1159X11 | |
| Whatman paper | VWR | 28297-216 |
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