Enkeltpartikelkryogenelektronmikroskopi (cryoEM) har udviklet sig til en udbredt metode til visualisering af biologiske makromolekyler¹. Drevet af fremskridt inden for direkte elektrondetektion ^2,3,4, dataindsamling⁵ og billedbehandlingsalgoritmer ^6,7,8,9,10 er cryoEM nu i stand til at producere næsten atomopløselige 3D-strukturer af et hurtigt voksende antal makromolekyler¹¹. Desuden kan brugerne ved at udnytte tilgangens enkeltmolekylekarakter bestemme flere strukturer fra en enkelt prøve 12,13,14,15, hvilket fremhæver løftet om at bruge de genererede data til at forstå heterogene strukturelle ensembler ^16,17. På trods af disse fremskridt er der fortsat flaskehalse i forberedelsen af kryoprøvegitteret.

Til strukturel karakterisering ved kryoEM skal biologiske prøver være godt dispergeret i vandig opløsning og derefter flashfryses gennem en proces kaldet vitrifikation^18,19. Målet er at fange partikler i et ensartet tyndt lag forglasset is suspenderet over regelmæssigt fordelte huller, der typisk skæres i et lag af amorft kulstof. Denne mønstrede amorfe kulstoffolie understøttes af et TEM-gitter med et net af kobber- eller guldstøttestænger. I standardarbejdsgange gengives gitre hydrofile ved hjælp af en plasmabehandling med glødudladning inden påføring af prøven. Overskydende væske blottes med filterpapir, hvilket gør det muligt for proteinopløsningen at danne en tynd flydende film over hullerne, der let kan forglases under nedfrysning. Almindelige udfordringer omfatter partikellokalisering til luft-vand-grænsefladen (AWI) og efterfølgende denaturering^20,21,22 eller vedtagelse af foretrukne orienteringer 23,24,25, partikelvedhæftning til kulstoffolien snarere end at migrere ind i hullerne og klyngedannelse og aggregering af partiklerne i hullerne²⁶. Uensartet istykkelse er en anden bekymring; Tyk is kan resultere i højere niveauer af baggrundsstøj i mikrografierne på grund af øget elektronspredning, mens ekstremt tynd is kan udelukke større partikler²⁷.

For at løse disse udfordringer er en række tynde støttefilm blevet brugt til at belægge gitteroverflader, så partikler kan hvile på disse understøtninger og ideelt set undgå interaktioner med luft-vand-grænsefladen. Grafenstøtter har vist stort løfte, dels på grund af deres høje mekaniske styrke kombineret med deres minimale spredningstværsnit, hvilket reducerer baggrundssignalet tilføjet af støttelaget²⁸. Ud over sit minimale bidrag til baggrundsstøj udviser grafen også bemærkelsesværdig elektrisk og termisk ledningsevne²⁹. Grafen- og grafenoxidbelagte gitre har vist sig at give højere partikeltæthed, mere ensartet partikelfordeling³⁰ og reduceret lokalisering til AWI²². Derudover giver grafen en støtteoverflade, der kan modificeres yderligere til: 1) indstille gitteroverfladens fysiokemiske egenskaber gennem funktionalisering 31,32,33; eller 2) parforbindelsesmidler, der letter affinitetsoprensning af proteiner af interesse 34,35,36.

I denne artikel har vi ændret en eksisterende procedure til belægning af kryoEM-gitre med et enkelt ensartet lag grafen³⁰. Ændringerne sigter mod at minimere nethåndtering i hele protokollen med det formål at øge udbyttet og reproducerbarheden. Derudover diskuterer vi vores tilgang til at evaluere effektiviteten af forskellige UV / ozonbehandlinger i gengivelsesgitter hydrofile inden nedkastning. Dette trin i kryoEM-prøveforberedelse ved hjælp af grafenbelagte gitre er kritisk, og vi har fundet vores enkle metode til at kvantificere den relative hydrofilicitet af de resulterende gitre nyttig. Ved hjælp af denne protokol demonstrerer vi nytten af at anvende grafenbelagte gitre til strukturbestemmelse ved at generere en højopløselig 3D-rekonstruktion af katalytisk inaktive S. pyogenes Cas9 i kompleks med guide-RNA og mål-DNA.