В данной работе мы представляем ассамблоидную модельную систему, имитирующую перекрестные помехи между несущей тканью сухожильного ядра и внешним компартментом, содержащим клеточные популяции, активированные болезнью и травмой. В качестве важного примера использования мы демонстрируем, как система может быть развернута для исследования активации внешних эндотелиальных клеток, связанных с заболеванием.
Сухожилия обеспечивают передвижение, передавая мышечные силы на кости. Они опираются на прочное сухожильное ядро, состоящее из коллагеновых волокон и популяций стромальных клеток. Это несущее ядро охватывается, питается и восстанавливается синовиальным слоем ткани, содержащим наружный отдел сухожилия. Несмотря на эту сложную конструкцию, травмы сухожилий являются распространенным явлением, и клиническое лечение по-прежнему опирается на физиотерапию и хирургическое вмешательство. Ограниченность имеющихся экспериментальных модельных систем замедлила разработку новых методов лечения, модифицирующих болезнь, и клинических режимов, предотвращающих рецидивы.
Исследования in vivo на людях ограничиваются сравнением здоровых сухожилий с терминальной стадией пораженных или разорванных тканей, взятых во время операции по восстановлению, и не позволяют провести лонгитюдное исследование основного заболевания сухожилий. Модели на животных in vivo также имеют важные ограничения, касающиеся непрозрачной физиологической сложности, этического бремени для животных и больших экономических затрат, связанных с их использованием. Кроме того, животные модели in vivo плохо приспособлены для систематического зондирования лекарств и путей многоклеточного, многотканевого взаимодействия. Более простые модельные системы in vitro также не оправдали ожиданий. Одной из основных причин является неспособность адекватно воспроизвести трехмерную механическую нагрузку, необходимую для осмысленного изучения клеток сухожилий и их функций.
Новая система 3D-моделирования, представленная здесь, решает некоторые из этих проблем, используя экспланты сухожилий хвоста мыши. Важно отметить, что эти экспланты легко доступны в больших количествах с одной мыши, сохраняют 3D-паттерны загрузки in situ на клеточном уровне и имеют внеклеточный матрикс, подобный in vivo. В этом протоколе даны пошаговые инструкции о том, как дополнить экспланты ядра сухожилий коллагеновыми гидрогелями, нагруженными эндотелиальными клетками мышечного происхождения, фибробластами сухожильного происхождения и макрофагами костного мозга для замещения популяций клеток, активируемых болезнью и травмой, во внешнем сухожильном компартменте. Показано, как полученные сухожильные ассамблоиды могут быть подвергнуты механическому воздействию или с помощью определенных стимулов микроокружающей среды для исследования возникающих многоклеточных перекрестных помех во время болезни и травмы.
Выполняя свою функцию передачи мышечных сил на кости для обеспечения подвижности, сухожилия подвергаются некоторым из самых экстремальных механических нагрузок, возникающих в человеческом теле 1,2,3. В связи со старением общества, растущей распространенностью ожирения и растущей популярностью занятий спортом, требующих механических усилий, распространенность заболеваний и травм сухожилий, по прогнозам, будет расти в развитых странах 4,5,6. Разработка новых, научно обоснованных и модифицирующих болезнь схем лечения для борьбы с этим ростом была затруднена ограничениями имеющихся в настоящее время модельных систем 1,7,8.
В идеале, модели восстановления заболеваний и травм должны позволять изучать, как орган-мишень обрабатывает определенный набор входных параметров (имитируя триггеры заболевания, Таблица 1) в измеримые выходные параметры (представляющие признаки заболевания, Таблица 2), контролируя при этом искажающие факторы. Исследования с использованием таких модельных систем позволят идентифицировать (пато-) физиологические процессы, лежащие в основе заболевания и восстановления травм, и получить знания, которые могут быть использованы для предотвращения или уменьшения признаков заболеваний и травм в клиниках. Применяя этот принцип к сухожилиям, полезная модельная система должна повторять центральные части реакции сухожилий in vivo на заболевание и травму, которые охватывают следующие признаки: микроповреждение, воспаление, неоваскуляризация, гиперцеллюлярность, ускоренный оборот матрикса и декомпартментализация 9,10,11,12,13,14,15 . Используя эти признаки в качестве основы, можно сделать следующие выводы для успешной системы моделирования заболеваний сухожилий и травм.
Предполагается, что механическая перегрузка является центральным фактором в повреждении сухожилий и патогенезе заболевания и, таким образом, является широко используемым экспериментальным подходом для создания микроповреждений16. Таким образом, контролируемая механическая нагрузка является основным условием для моделей восстановления заболеваний и травм сухожилий. В идеале модельная система допускает три основных режима: одинарное нагружение растяжением до повреждения, усталостное нагружениеи разгрузка 8,17,18. При механической деформации тканевые резидентные клетки испытывают сложное сочетание сил растяжения, сил сдвига (из-за скольжения коллагеновых волокон, окружающих клетки) и сил сжатия, возникающих во время разгрузки или вблизи энтезиса19,20. Модельные системы должны воспроизводить эти сложные схемы нагружения как можно точнее.
Альтернативным способом введения матриксного микроповреждения является использование биохимических стрессоров, которые имитируют системную предрасположенность к заболеваниям и травмам сухожилий, такие как (про)воспалительные цитокины, окислительный стресс или высокие концентрации глюкозы 21,22,23. Следовательно, контролируемое нишевое микроокружение является выгодным для модельной системы восстановления заболеваний и травм сухожилий.
Общей предпосылкой для того, чтобы модельные системы могли повторять воспаление, неоваскуляризацию и гиперцеллюлярность, является селективное присутствие клеточных популяций, которые управляютэтими процессами. Для воспалительных процессов эти популяции включают нейтрофилы, Т-клетки и макрофаги, в то время как эндотелиальные клетки и перициты необходимы для изучения неоваскуляризации 25,26,27,28,29. Фибробласты сухожилий не только жизненно важны для восстановления сухожилий, но и, как пролиферативные и мигрирующие клетки, также частично ответственны за локальную гиперцеллюлярность, наблюдаемую при заболеваниях сухожилий 30,31,32,33,34,35,36.
Помимо изменений в популяциях резидентных клеток, состав матрикса сухожилий также изменяется при заболеваниях и травмах сухожилий 7,37,38,39,40. Для представления правильных сигналов микросреды, связанных с заболеванием, модельные системы должны быть способны интегрировать состав внеклеточного матрикса, соответствующий целевой стадии заболевания или травмы, например, путем включения соответствующих пропорциональных комбинаций коллагена-1, коллагена-3 и клеточного фибронектина41.
Компартментализация здоровых сухожилий в сухожильный сердечник и внешние отделы (т.е. эндотенон, эпитенон и паратенон) занимает центральное место в их функции и часто нарушается в больных или поврежденных сухожилиях 1,42,43,44,45,46,47 . Таким образом, включение 3D-компартментализации сухожилий в системы моделей сухожилий необходимо не только для более точного моделирования процессов, лежащих в основе де- и рекомпартментализации, но и для установления правильных пространственно-временных градиентов цитокинов и питательных веществ48,49.
Наконец, модульность является еще одним центральным преимуществом модельных систем, позволяющим исследователям комбинировать правильный относительный вклад и взаимодействие между ранее описанными стрессорами во время исследуемых процессов 8,17.
Помимо выбора оптимальных модальностей ввода, важным этапом является возможность измерения, наблюдения и отслеживания изменений в результирующем результате. Механические свойства модельной системы (т.е. длина области носка, линейный модуль упругости, максимальная растягивающая деформация, максимальное растягивающее напряжение, усталостная прочность и релаксация напряжений) являются здесь центральными, поскольку они характеризуют основную функцию сухожилия 50,51,52. Чтобы связать эти функциональные изменения с изменениями на тканевом уровне, важно использовать методы, обнаруживающие повреждение структурного матрикса (коллагена) и отслеживающие пролиферацию и рекрутирование соответствующих заболеванию и репарации клеточных популяций 30,53,54,55,56,57,58,59,60.
Для изучения возникающих перекрестных помех между клетками и клетками-матриксами необходимо уметь выделять или маркировать белки в адекватных количествах для количественного определения (т.е. ИФА, протеомика, иммуногистохимия, проточная цитометрия)14,21,61,62. Также должен быть возможен популяционный или, по крайней мере, компарт-специфический анализ экспрессии генов (т.е. флуоресцентно-активируемая сортировка клеток [FACS], секвенирование одноклеточных/объемных РНК и количественная полимеразная цепная реакция в реальном времени (ОТ-кПЦР))21,24,27,63. Модельная система должна позволять измерять как можно больше вышеупомянутых выходных параметров на одном и том же образце и на нескольких образцах достаточно быстро, чтобы обеспечить высокую производительность исследований.
Среди модельных систем, доступных в настоящее время для изучения заболеваний сухожилий и восстановления травм человека, само человеческое тело, безусловно, является наиболее репрезентативным. Он также наименее совместим с экспериментальным вмешательством. В то время как пациенты с острыми повреждениями сухожилий в изобилии доступны для клинических исследований, пациенты с ранней тендинопатией (наиболее распространенным заболеванием сухожилий) в значительной степени бессимптомны и часто остаются клинически незамеченными до тех пор, пока не проявятся более серьезные изменения 14,64,65. Это затрудняет определение критического момента, когда гомеостаз сухожилий нарушает норму, и механизмы, стоящие за этим срывом 16,66,67,68,69. Кроме того, извлечение биопсии из здоровых сухожилий является этически сложной задачей, так как это может привести к стойкому повреждению. Остатки сухожилий подколенного сухожилия после операции по реконструкции передней крестообразной связки часто используются в качестве здоровых контрольных групп, но, возможно, отличаются по функциям, механическим свойствам, клеточным популяциям и составу матрикса по сравнению с вращательной манжетой плеча, ахилловыми сухожилиями и сухожилиями надколенника, обычно поражаемыми заболеваниями и травмами сухожилий 70,71,72,73.
Модели на животных in vivo более доступны и понятны, но их использование налагает значительное этическое бремя на животных и экономические издержки на исследователей. Кроме того, у большинства популярных модельных животных тендинопатические поражения либо не развиваются спонтанно (например, у крыс, мышей, кроликов), либо отсутствуют праймеры и генетически модифицированные штаммы, необходимые для отслеживания вовлеченных в него путей многоклеточной коммуникации (например, у лошадей, кроликов).
Простые 2D-модельные системы in vitro находятся на другой стороне спектра сложности/податливости и лучше позволяют контролируемо, эффективно по времени изучать специфические пути межклеточной коммуникации в ответ на более контролируемый набор триггеров 8,74. Тем не менее, эти упрощенные системы, как правило, не в состоянии повторить многомерную механическую нагрузку (т.е. растяжение, сжатие и сдвиг), которая является центральной для функциональности сухожилий. Кроме того, (слишком) высокая жесткость пластика для культуры тканей имеет тенденцию перекрывать любые матричные сигналы, предоставляемые покрытиями, предназначенными для имитации интересующего болезненного состояния75,76.
Чтобы преодолеть этот недостаток, были разработаны все более сложные системы тканеинженерных 3D-моделей, обеспечивающие нагружаемую матрицу, состав которой, по крайней мере, частично соответствует желаемому состоянию заболевания 77,78,79. Тем не менее, эти системы не только испытывают трудности с точным воспроизведением сложных составов внеклеточного матрикса in vivo и моделей клеточной нагрузки, но, как правило, не имеют долгосрочной нагружаемости и компартментных интерфейсов, необходимых для изучения путей межкомпонентной коммуникации, которые координируют заболевание сухожилий и восстановление травмы 48,49,80.
Модельные системы эксплантов сухожилий ex vivo имеют явное преимущество в виде встроенной матричной композиции, подобной in vivo, которая включает перицеллюлярные ниши, перекрестные компартментные барьеры, а также пространственно-временные градиенты цитокинов/питательных веществ и повторяет сложные паттерны нагрузки при растяжении8. В результате зависящих от размера пределов диффузии питательных веществ эксплантаты от более крупных животных моделей (например, лошадей) трудно сохранить живыми для долгосрочного изучения заболеваний сухожилий и восстановления травм 81,82,83. Между тем, более мелкие экспланты от видов мышей (например, ахиллово сухожилие, сухожилие надколенника) трудно воспроизводимо зажимать и механически нагружать. Их размер также ограничивает количество материала, который может быть собран для считывания на клеточном, белковом и генном уровнях без объединения образцов и снижения производительности. В этом смысле пучки сухожилий хвоста мышей предлагают потенциал для высокопроизводительного изучения заболеваний сухожилий и восстановления травм, поскольку они легко доступны в больших количествах у одной мыши, сохраняют сложный состав перицеллюлярного матрикса in vivo и повторяют паттерны клеточной нагрузки. Однако в процессе экстракции они теряют большую часть своего внешнего компартмента и содержащиеся в нем популяции сосудистых, иммунных и фибробластов, которые, как теперь считается, приводят к заболеванию и восстановлению сухожилий.
Чтобы восполнить этот пробел, была разработана модельная система, сочетающая в себе преимущества эксплантатов стержней, полученных из сухожилий хвоста мыши, с преимуществами модельных систем на основе 3D-гидрогеля. Эта модельная система состоит из нагруженного клетками (коллаген-1) гидрогеля, отлитого вокруг эксплантов сухожилий хвоста84,85. В этой статье подробно описаны необходимые этапы производства, а также полезные данные, которые могут быть получены путем совместного культивирования стержневых эксплантов (внутренний компартмент) внутри эндотелиального коллагенового гидрогеля типа 1 (внешний компартмент).
В целом, представленная здесь система ассамблоидных моделей имеет несколько важных этапов, которые следует выделить. Во-первых, модельная система хороша настолько, насколько хороши ее компоненты. Очень важно проверить под микроскопом стержневую эксплантацию и клеточные популяции, которые будут засеяны, прежде чем начинать процесс сборки. Не менее важно хотя бы один раз верифицировать фенотип изолированных клеточных популяций с помощью проточной цитометрии. Особенно при первом использовании новой партии коллагена-1 полезно проверить скорость сшивания в пробном запуске, прежде чем встраивать в него клетки. Сборка сборки требует большого количества ручных манипуляций, что повышает риск инфекций. Чтобы свести к минимуму риск заражения, работайте в стерильном биозащитном колпаке с ламинарным потоком воздуха, часто меняйте перчатки и дезинфицируйте перчатки, а также рабочее пространство 80% этиловым спиртом. По тем же причинам не используйте держатели зажимов, напечатанные на 3D-принтере, более одного раза. Перед самим процессом встраивания важно держать все компоненты гидрогеля (раствор сшивания, раствор коллагена-1) на льду, чтобы предотвратить преждевременное сшивание. Следовательно, после добавления клеток в сшивающий раствор необходимо работать быстро, чтобы ограничить гибель клеток из-за высокого pH и низкой температуры сшивающего раствора. Чтобы предотвратить гибель клеток в стержневом эксплантате, связанную с высыханием, аспирируйте среду, покрывающую зажатые стержневые эксплантаты, непосредственно перед смешиванием сшивающего раствора с раствором коллагена-1. Чтобы гарантировать центральное размещение стержневого экспланта в гидрогеле, идеально отливать гидрогель вокруг слегка натянутого стержневого эксплантата. Для этого используйте установочный штифт и винт-болт M3 x 16 мм, чтобы зафиксировать держатели зажимов на (напечатанном на 3D-принтере) наборе пластин с отверстиями соответствующей длины. По истечении 50-минутного времени полимеризации эксплант встроенного стержня может быть снова натянут в зависимости от желаемых условий культивирования. Степень напряжения, испытываемого ассамблоидом во время культивирования, оказывает глубокое влияние на результаты экспериментов и должна быть одинаковой для всех образцов и условий21.
Тем не менее, большое влияние механического (не)нагружения на результаты эксперимента является основным преимуществом ассамблоидной модели перед большинством тканеинженерных альтернатив, особенно с учетом того, что поддерживаемый матричный состав стержневого экспланта должен также воссоздавать сложные паттерны нагрузки in vivo на клеточном уровне90. В то время как на практике до сих пор было продемонстрировано только измерение линейного модуля упругости, максимальной растягивающей деформации и максимального растягивающего напряжения ассамблоидов, протоколы для измерений усталостной прочности и релаксации напряжений были описаны для эксплантов сердечника сухожилия в других местах и должны быть применимы к ассамблоидам91,92. В дополнение к схемам нагружения, подобным in vivo, многоуровневая модульность ассамблоида, вероятно, является его самым большим преимуществом. Благодаря индивидуальным культуральным камерам для каждого образца можно установить контролируемый набор нишевых условий (например, температура, напряжение кислорода, концентрация глюкозы, добавки, стимуляторы, ингибиторы и статическое растяжение планшетом). Во-вторых, жесткость матрицы и матричный состав внешнего компартмента настраиваются с помощью гидрогелевого состава и позволяют, например, изучать влияние все более больного тканевого микроокружения путем включения большего количества коллагена-3 и клеточного фибронектина 93,94,95. Оцененные клеточные популяции во внешнем компартменте легко адаптируются путем выбора клеток для посева, но также могут быть модифицированы в экспланте сухожильного ядра путем использования установленных генетически модифицированных клеточных линий и мышиных линий (т.е. истощение клеток ScxLin)96. Различия в матриксе и клеточном составе двух компартментов дополнительно обеспечивают уникальную компартментализированную 3D-структуру, которая является еще одним центральным признаком сухожилия 1,30,46.
При использовании этой системы важно учитывать последствия модульности системы для детализации параметров результата. В то время как пролиферация и рекрутирование клеток могут быть оценены для каждого компартмента отдельно, механические свойства, компоненты секретома и продукты деградации в настоящее время могут быть измерены только для всей совокупности. Что касается производительности, то один специально обученный человек может подготовить до 50 сборок за обычный рабочий день, при этом основным узким местом является процедура зажима. Несмотря на то, что некоторые из методов считывания являются взаимоисключающими, можно многократно оценивать механические свойства и компоненты секретома на одном и том же образце, а также состав клеточной популяции (проточная цитометрия), клеточный транскриптом (ОТ-кПЦР, РНК-секвенирование) или матрикс и распределение клеток (иммуноцитохимия/флуоресцентная микроскопия) в конечных точках. В предыдущих публикациях эти методы были использованы для обширной характеристики межклеточных, кросс-компартментных взаимодействий в ядре // фибробластах и ядро // ассамблоидах макрофагов, подверженных воздействию пораженной ниши 84,85. В данной работе была исследована способность ассамблоидной модельной системы исследовать кросс-компартментарное взаимодействие между ядром и внешними эндотелиальными клетками при различных стимулах микросреды.
Модульность модельной системы позволяет в будущем совершенствовать метод, что необходимо для преодоления следующих ограничений текущей итерации проекта. Анализ проточной цитометрии, представленный в этой работе, и данные секвенирования РНК отдельных клеток, опубликованные недавно, показали, что популяции теноцитов, происходящих из сухожилий, и популяции, полученные из ахиллова сухожилия, более неоднородны, чем предполагалось ранее 24,34,59,84,97. Кроме того, миграционное поведение первоначально резидентных популяций клеток ядра или гидрогеля размывает ассамблоидную компартментализацию во время культивирования. Оба фактора вместе затрудняют отнесение транскриптомных различий к конкретным типам клеток и отделение процессов пролиферации от процессов, основанных на миграции. Это ограничение может быть преодолено путем уточнения входной популяции с помощью флуоресцентно-активируемой сортировки клеток (FACS) на основе клеточного состава здоровых или больных сухожилий, охарактеризованного в недавних исследованиях in vivo, улучшения считывания за счет внедрения секвенирования одноклеточной РНК и интеграции маркеров пролиферации, таких как окрашивание EdU (5-этинил-2′-дезоксиуридин) во время микроскопии.
Ассамблоиды, представленные здесь, также имеют общий недостаток с большинством доступных в настоящее время систем in vitro, которые имитируют больные органы, отделенные отостальной части тела. Тем не менее, используемая здесь платформа на основе культуральной камеры хорошо позиционирует модельную систему для интеграции в мультиорганную платформу, где соединяются ассамблоиды, имитирующие различные органы, и могут быть изучены межорганные взаимодействия.
По своей сути модельная система основана на позиционных сухожилиях грызунов, что приводит к собственному уникальному набору недостатков. Во-первых, переводимость результатов затруднена тем, что мыши дикого типа не развиваются или страдают от заболеваний сухожилий 8,100,101. Интеграция тканей и клеток человека или недавно разработанных линий мышей, которые демонстрируют аспекты заболевания сухожилий, может облегчитьэту проблему. Переход к ассамблоиду, основанному на человеке, особенно интересен, поскольку он позволит проводить исследования с тканями, полученными от пациентов из различных заболеваний сухожилий (например, тендинита, тендиноза или перитендинита) и даже с устойчивыми к лечению донорами, что может открыть более персонализированные программы лечения. Во-вторых, эксплантаты сухожилий хвоста мышей не особенно хорошо справляются с микроповреждениями, вызванными перегрузкой, что ограничивает применимость модельной системы для изучения острого повреждения сухожилий.
По всем этим причинам ассамблоиды эксплантов // гидрогеля находятся в отличном положении для изучения биологии сухожилий, структурно-функциональных взаимодействий матрицы и кросс-компартментальных взаимодействий между конкретными клеточными популяциями в ответ на микроповреждения, индуцированные нишей. Информация, полученная в результате этих довольно высокопроизводительных исследований, может дать направление исследованиям и разработке методов лечения in vivo .
The authors have nothing to disclose.
Эта работа была профинансирована грантом ETH 1-005733
0.4 mm x 25 mm injection needle (G27) | Sterican | 9186174 | |
3D printing filament: Clear polylactic acid prusament | Prusa | NA | |
4% formaldehyde | Roti-Histofix | P087.4 | |
Accutase cell detachment solution | Sigma-Aldrich | A6964-100ML | |
Amphotericin | VWR | L0009-100 | |
Attachable digital C-mount camera: Moticam 2 | Motic | NA | |
Bolt screw M3 x 16 mm, stainless steel | RS PRO | 1871235 | |
Bolt screw M3 x 6 mm, stainless steel | RS PRO | 1871207 | |
CaCl2 | Sigma-Aldrich | C5670 | |
CD146 antibody: PE anti-mouse | BioLegend | 134703 | |
CD206 antibody: Alexa Fluor 488 anti-mouse | BioLegend | 141709 | |
CD31 antibody: Alexa Fluor 488 anti-mouse | BioLegend | 102413 | |
CD86 antibody: PE anti-mouse | BioLegend | 105007 | |
Collagenase I | Thermo Fisher Scientific | 17100017 | |
Collagenase IV | Gibco | 17104-019 | |
Dialyzed Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F0392-100ML | |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | 7000183 | |
Dispase II | Sigma-Aldrich | D4693-1G | |
DMEM/F12 | Sigma | 7002211 | |
Dowel Pin, 3 mm x 16 mm, stainless steel | Accu | HDP-3-16-A1 | |
Dragon Skin 10 Slow/1 silicone | KauPO | 09301-004-000001 | |
Endopan 3 Kit | Pan-Biotech | P04-0010K | |
Endothelial cell growth supplement | Lonza | CC-3162 | |
Eppendorf safe-lock plastic tubes (1.5 mL) | Eppendorf | 30121023 | |
Ethidium homodimer, EthD-1, 2 mM stock in DMSO | Sigma-Aldrich | 46043-1MG-F | |
F4/80 antibody: Apc/fire 750 anti-mouse | BioLegend | 123151 | |
Falcon plastic tube (15 mL) | Corning | 352096 | |
Falcon plastic tube (50 mL) | Corning | 352070 | |
Flow cytometer: LSR II Fortessa | BD Bioscience | 23-11617-02 | |
Gelatin | Invitrogen | D12054 | |
Hellmanex III alkaline cleaning concentrate | Sigma | Z805939-1EA | |
Heparin | Sigma-Aldrich | H3149-10KU | |
Hydroxyproline assay | Sigma-Aldrich | MAK008 | |
Image analysis software: Motic Images Plus 3.0 ML | Motic | NA | |
L-Ascorbic Acid Phosphate Magnesium Salt n-Hydrate | Wako Chemicals | 013-19641 | |
LSE Low Speed Orbital Shaker | Corning | 6780-FP | |
MEM non-essential amino acids | Sigma | 7002231 | |
Mouse macrophage-stimulating factor (m-CSF) | PeproTech | 315-02-50ug | |
MSD assay | Mesoscale Discovery | various | |
NucBlue | Thermo Fisher Scientific | R37605 | |
Nylon mesh strainer cap, 100 µm | Corning | 734-2761 | |
Original Prusa i3 MK3S 3D printer | Prusa | i3 MK3S | |
Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | |
Phosphate-buffered saline (PBS), ph 7.4, sterile, 10 L | Gibco | 10010001 | |
Puromycin | Gibco | A1113803 | |
RBC lysis buffer | VWR | 786-650 | |
recombinant m-CSF | PeproTech | 315-02 | |
RNA extraction kit: Rneasy plus Micro | Qiagen | 74034 | |
Slicing software: PrusaSlicer | Prusa | NA | Version 2.6.0 or higher |
Sterile Cell Strainer 100 µm | Fisherbrand | 22363549 | |
Surgical scalpel blade No. 21 | Swann-Morton | 307 | |
Trizol reagent | Thermo Fisher Scientific | 15596018 | |
Trypsin-EDTA (0.5 %) | Gibco | 15400054 |