Summary

Registro da Integridade Funcional da Barreira em bEnd.3 Células Endoteliais Vasculares via Detecção de Resistência Elétrica Transendotelial

Published: September 29, 2023
doi:

Summary

Este protocolo descreve um modelo in vitro confiável e eficiente da barreira sanguínea cerebral. O método utiliza células endoteliais vasculares cerebrais de camundongos bEnd.3 e mede a resistência elétrica transmembrana.

Abstract

A barreira hematoencefálica (BHE) é uma estrutura fisiológica dinâmica composta por células endoteliais microvasculares, astrócitos e pericitos. Ao coordenar a interação entre o trânsito restrito de substâncias nocivas, a absorção de nutrientes e a depuração de metabólitos no cérebro, a BHE é essencial na preservação da homeostase do sistema nervoso central. A construção de modelos in vitro do BBB é uma ferramenta valiosa para explorar a fisiopatologia de distúrbios neurológicos e criar tratamentos farmacológicos. Este estudo descreve um procedimento para criar um modelo in vitro de células BBB monocamada por semeadura de células bEnd.3 na câmara superior de uma placa de 24 poços. Para avaliar a integridade da função de barreira celular, o voltímetro de células epiteliais convencional foi usado para registrar a resistência elétrica transmembrana de células normais e hipóxicas induzidas por CoCl2 em tempo real. Antecipamos que os experimentos acima fornecerão ideias eficazes para a criação de modelos in vitro de BBB e drogas para tratar distúrbios de doenças do sistema nervoso central.

Introduction

A BHE é uma interface biológica única entre a circulação sanguínea e o tecido nervoso, que é composto por células endoteliais vasculares, pericitos, astrócitos, neurônios e outras estruturas celulares1. O fluxo de íons, produtos químicos e células entre o sangue e o cérebro é estritamente regulado por essa barreira. Essa homeostase protege os tecidos nervosos contra toxinas e patógenos, além de permitir o funcionamento adequado dos nervos cerebrais 2,3. A manutenção da integridade da BHE pode efetivamente prevenir o desenvolvimento e a progressão de distúrbios que afetam o sistema nervoso central, como disfunção neuronal, edema e neuroinflamação4. No entanto, as propriedades fisiológicas únicas da BHE impedem que mais de 98% dos medicamentos de pequenas moléculas e 100% dos fármacos macromoleculares entrem no sistema nervoso central5. Portanto, aumentar a penetração de medicamentos através da BHE durante o desenvolvimento de fármacos para o sistema nervoso central é essencial para alcançar a eficácia terapêutica 6,7. Embora a triagem de substratos por simulação computacional tenha aumentado significativamente a probabilidade de candidatos a fármacos cruzarem o BBB, modelos de BBB confiáveis e acessíveis in vitro/in vivo ainda são necessários para atender às necessidades da pesquisa científica8.

Uma técnica rápida e acessível para triagem de fármacos em alto rendimento é o modelo in vitro 9. Para lançar luz sobre os processos fundamentais dos efeitos dos medicamentos na função BBB e sua participação no desenvolvimento e progressão da doença, uma série de modelos simplificados in vitro de BBB foi criada. Atualmente, os modelos de BHE in vitro comuns são os modelos monocamada, co-cultura, dinâmico e microfluídico 10,11,12, construídos por células endoteliais vasculares e astrócitos, pericitos ou micróglia 13,14. Embora as culturas de células 3D estejam mais alinhadas com a estrutura fisiológica do BBB15, sua aplicação como meio de triagem de drogas para BBB ainda é limitada por seu design intrincado e reprodutibilidade inferior. Em contraste, o modelo in vitro de monocamada é o mais frequentemente utilizado para pesquisar a BBB e é aplicável para determinar a expressão de transportadores de membrana e proteínas de junção apertada em células específicas.

A medição da resistência elétrica transmembrana (TEER) é uma técnica para avaliar e monitorar a camada de células através da resistência e avaliar a integridade celular e a permeabilidade da barreira. Inserindo-se simultaneamente dois eletrodos no meio de crescimento ou solução tampão de cada lado da monocamada, é possível medir a corrente alternada ou a impedância elétrica através da camada compacta da célula 16,17. Para determinar se o modelo de BBB in vitro foi adequadamente criado, a mensuração do TEER será usualmente empregada como padrão-ouro18. Por outro lado, a tendência da ação do medicamento sobre a permeabilidade da BHE pode ser predita com precisão medindo-se a mudança na resistência elétrica da camada celular após o envolvimento da droga19. Por exemplo, Feng e col. descobriram que o catalpol (o monômero ativo primário de rehmanniae) poderia efetivamente reverter a regulação negativa induzida por lipopolissacarídeo de proteínas de junção apertada no BBB e aumentar o valor TEER da camada de células endoteliais cerebrais de camundongos20.

A resposta neuroinflamatória costuma ser a principal causa de desequilíbrio da homeostase BBB21. O tratamento hipóxico para induzir lesão neuroinflamatória é o principal método para destruir a barreira hematoencefálica, incluindo principalmente métodos físicos e métodos de reagentes químicos. A primeira utiliza primariamente uma incubadora de três gases para variar o conteúdo de oxigênio no ambiente de crescimento celular para simular condições hipóxicas22, enquanto a segunda é obtida pela introdução artificial de reagentes desoxi como a CoCl2 no meio de cultura celular23. As células permanecerão em uma condição desoxigenada se Fe2+ for substituído por Co2+ no heme. Se o Fe2+ for substituído por Co2+ no grupo catalítico, a atividade da prolina hidroxilase e do aspartato hidroxilase será inibida, resultando em um acúmulo do fator induzível por hipóxia-1α (HIF-1α)24. Sob hipóxia persistente, a desfosforilação do HIF-1α no citoplasma desencadeia a morte celular e ativa o fator de crescimento endotelial vascular, o que, em última instância, eleva a permeabilidade vascular. Em estudos prévios25,26, foi bem demonstrado que a hipóxia pode reduzir significativamente a expressão de proteínas de tight junction endotelial para aumentar a permeabilidade da BHE. Neste estudo, a curva de resistência temporal de células bEnd.3 semeadas em placas de 24 poços foi medida para criar um modelo de BBB simples. Usando este modelo, caracterizamos as mudanças na célula TEER após a intervenção com CoCl2, a fim de construir um modelo celular que possa ser usado para rastrear drogas para proteção BBB.

Protocol

NOTA: Células endoteliais derivadas do cérebro de camundongos.3 (bEnd.3) foram inoculadas nas câmaras de uma placa de 24 poços para construir um modelo in vitro simples de BBB sob condições específicas de meio. O TEER das células normais e hipóxicas foi medido pelo medidor TEER (Figura 1 e Figura 2). 1. Preparação da solução Preparar o meio de cultura celular DMEM contendo FBS (10%, v/v…

Representative Results

Este protocolo permitiu o registro das mudanças nos valores de resistência das células de acordo com os parâmetros estabelecidos no resistor transendotelial. A viabilidade de células bEnd.3 (número de células vivas) tratadas com diferentes concentrações de CoCl2 foi avaliada pelo ensaio CCK-8. O maior dano celular produzido pela CoCl2 foi representado pela menor viabilidade celular. Verificamos que 300 μM de CoCl2 foi significativamente citotóxico in vitro, e essa conc…

Discussion

Um dos órgãos corporais mais desenvolvidos, o cérebro controla uma ampla gama de processos fisiológicos intrincados, incluindo memória, cognição, audição, olfato e movimento27. O cérebro é um dos órgãos mais complicados e doentes do corpo humano ao mesmo tempo. A ocorrência de muitas doenças do sistema nervoso central apresenta tendência crescente ano após ano devido a fatores como poluição do ar, padrões alimentares irregulares e outros fatores 27,28,29…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Agradecemos o apoio financeiro da Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (82274207 e 82104533), do Programa Chave de Pesquisa e Desenvolvimento de Ningxia (2023BEG02012) e do Projeto de Promoção de Pesquisa Acadêmica Xinglin da Universidade de Chengdu da TCM (XKTD2022013).

Materials

24-well transwell plate Corning (Corning 3470, 0.33 cm2, 0.4 µm) 10522023
75 % ethanol ChengDu Chron Chemicals Co,.Ltd 2023052901
96-well plate Guangzhou Jet Bio-Filtration Co., Ltd 220412-078-B
bEnd.3 cells Hunan Fenghui Biotechnology Co., Ltd CL0049
Cell counting kit-8 (CCK-8) Boster Biological Technology Co., Ltd BG0025
Cell culture dish (100mm) Zhejiang Sorfa Life Science Research Co., Ltd 1192022
Cobalt Chloride (CoCl2) Sigma 15862
DMSO Boster Biological Technology Co., Ltd PYG0040
Dulbecco's modified eagle medium (1x) Gibco ThermoFisher Scientific 8121587
Fetal bovine serum Gibco ThermoFisher Scientific 2166090RP
GraphPad Prism software GraphPad Software 9.0.0(121)
Matrigel (Contains collagen IV) MedChemexpress HY-K6002
Microplate reader Molecular Devices SpectraMax iD5
OriginPro 8 software OriginLab Corporation v8.0724(B724)
Penicillin-Streptomycin (100x) Boster Biological Technology Co., Ltd 17C18B16
Phosphate buffered saline (PBS, 1x) Gibco ThermoFisher Scientific 8120485
Sodium hypochlorite ChengDu Chron Chemicals Co,.Ltd 2022091501
Transmembrane resistance meter World Precision Instruments LLC VOM3 (verison 1.6)
Trypsin 0.25% (1x) HyClone J210045

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Fan, F., Jiang, H., Hou, Y., Zhang, Y., Zhao, Q., Zeng, Y., Meng, X., Wang, X. Barrier Functional Integrity Recording on bEnd.3 Vascular Endothelial Cells via Transendothelial Electrical Resistance Detection. J. Vis. Exp. (199), e65938, doi:10.3791/65938 (2023).

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