Desarrollo y Aplicación de Ensayos Biofísicos para la Evaluación de la Formación de Complejos Ternarios Inducida por Quimeras Dirigidas a la Proteólisis (PROTACS)

La poliubiquitinación de proteínas en la célula es un proceso estrechamente regulado que involucra enzimas de la familia de la ubiquitina ligasa ^1,2. Las enzimas terminales en la vía son las ligasas de ubiquitina E3 que unen covalentemente las moléculas de ubiquitina a sus socios de unión a proteínas³. La poliubiquitinación de esos socios de unión a proteínas se dirige a ellos para la degradación proteolítica por el proteasoma⁴. Este sistema forma parte del proceso de homeostasis de proteínas que se ha aprovechado terapéuticamente para inducir la degradación de proteínas implicadas en la enfermedad⁵. Las moléculas pequeñas que inducen la interacción entre las ligasas de ubiquitina E3, como la ligasa E3 de Von Hippel-Lindau (VHL) o el cereblon (CRBN), suelen estar compuestas por una ojiva de unión a la ligasa E3 conectada por un enlazador flexible a una ojiva que se une a la proteína que se destina a la degradación. Estas moléculas heterobifuncionales se conocen comúnmente como quimeras dirigidas a la proteólisis o PROTACS⁶.

El desarrollo de PROTACS implica la evaluación de la capacidad de las moléculas para inducir la degradación de proteínas en las células. Se han desarrollado muchos sistemas de ensayo celular que monitorizan la interacción inducida entre la proteína diana y los componentes de la ligasa E3, como VHL o CRBN, tras el tratamiento de las células con una molécula PROTAC. Uno de estos ensayos celulares, el sistema nanoluc-Halotag⁷, involucra una ligasa E3 fusionada con el aceptor de Halotag y una proteína diana marcada con un donante de nanoluc. La formación de complejos ternarios acerca el donante de nanoluc y el aceptor de Halotag, lo que permite la transferencia de energía del donante al aceptor, lo que resulta en la emisión de luz. Las variaciones de este sistema se pueden utilizar para evaluar la permeabilidad celular de las moléculas PROTACS⁸ o los cambios en el nivel relativo de ubiquitinación de la proteína diana⁹. Si bien estos sistemas celulares son esenciales para impulsar la optimización de PROTACS, la formación de complejos entre las ligasas E3 y las proteínas destinadas a la degradación es un proceso de varios pasos^10,11. La cinética y termodinámica de las interacciones binarias y ternarias involucradas contribuyen a la eficiencia, ubiquitinación y la degradación resultante de la proteína^12,13,14.

En este trabajo se describen los protocolos que pueden adaptarse para la caracterización biofísica de la formación de complejos ternarios inducidos por PROTACS utilizando resonancia de plasmón de superficie (SPR), interferometría de biocapas (BLI) y calorimetría de titulación isotérmica (ITC). Los protocolos SPR e ITC para la molécula MZ1 PROTAC que induce la formación de complejos ternarios entre Brd4^BD2 y VHL derivados de los reportes de la literatura^13,15 y aquí descritos fueron capaces de recapitular los resultados reportados con alguna modificación de los procedimientos reportados^, los cuales serán discutidos. En este informe se incluye una descripción de un ensayo BLI utilizado para evaluar la formación de complejos ternarios entre MZI, Brd4^BD2 y VHL. Las mediciones de afinidad de BLI fueron consistentes con las observadas en SPR e ITC. También se describe un protocolo previamente publicado en el que se desarrolló un ensayo SPR para evaluar la formación de complejos ternarios inducidos por PROTAC entre PPM1D, una proteína fosfatasa Ser/Thr cuya expresión es inducida de forma dependiente de p53¹⁶, y CRBN. En este caso, la molécula PROTAC tiene una afinidad nanomolar por PPM1D, pero solo una afinidad micromolar por CRBN. En este caso, la unión de la molécula PROTAC a CRBN no es saturable, lo que da lugar al “efecto gancho” comúnmente observado. El efecto gancho es una propiedad de tres sistemas corporales en los que hay dos especies que pueden formar un complejo heterotrimérico cuando ambas están unidas a una molécula puente (Figura 1)¹⁷. El efecto gancho se observa cuando la especie puente está en exceso de concentración en relación con las otras dos especies. El estado resultante es aquel en el que las interacciones binarias superan a las interacciones ternarias. Los sistemas en los que se observa el efecto gancho requieren consideraciones específicas de diseño experimental que se analizan en este informe. Se proporcionan conceptos generales y requisitos de reactivos para evaluar la utilización de ensayos biofísicos para la evaluación de la formación de complejos ternarios inducidos por PROTAC.