Summary

Een geautomatiseerd kweeksysteem voor het onderhouden en differentiëren van door de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen

Published: January 26, 2024
doi:

Summary

Hier presenteren we een protocol voor een geautomatiseerd celkweeksysteem. Dit geautomatiseerde kweeksysteem vermindert arbeid en komt ten goede aan de gebruikers, waaronder onderzoekers die niet bekend zijn met het hanteren van geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPS), van het onderhoud van iPS-cellen tot differentiatie in verschillende soorten cellen.

Abstract

Van door de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSC’s) met een oneindig zelfprolifererend vermogen wordt verwacht dat ze toepassingen hebben op tal van gebieden, waaronder de opheldering van zeldzame ziektepathologieën, de ontwikkeling van nieuwe geneesmiddelen en regeneratieve geneeskunde die gericht is op het herstellen van beschadigde organen. Desondanks is de maatschappelijke implementatie van hiPSC’s nog steeds beperkt. Dit is deels te wijten aan de moeilijkheid om differentiatie in cultuur te reproduceren, zelfs met geavanceerde kennis en geavanceerde technische vaardigheden, vanwege de hoge gevoeligheid van iPSC’s voor minieme veranderingen in de omgeving. De toepassing van een geautomatiseerd kweeksysteem kan dit probleem oplossen. Experimenten met een hoge reproduceerbaarheid, onafhankelijk van de vaardigheden van een onderzoeker, kunnen worden verwacht volgens een gedeelde procedure tussen verschillende instituten. Hoewel er eerder verschillende geautomatiseerde kweeksystemen zijn ontwikkeld die iPSC-culturen kunnen handhaven en differentiatie kunnen induceren, zijn deze systemen zwaar, groot en kostbaar omdat ze gebruik maken van gehumaniseerde, meervoudig gearticuleerde robotarmen. Om de bovenstaande problemen te verbeteren, hebben we een nieuw systeem ontwikkeld met behulp van een eenvoudig x-y-z as schuifrailsysteem, waardoor het compacter, lichter en goedkoper kan zijn. Bovendien kan de gebruiker in het nieuwe systeem eenvoudig parameters wijzigen om nieuwe afhandelingstaken te ontwikkelen. Zodra een taak is vastgesteld, hoeft de gebruiker alleen nog maar de iPSC voor te bereiden, de reagentia en verbruiksartikelen die nodig zijn voor de gewenste taak van tevoren te leveren, het taaknummer te selecteren en de tijd op te geven. We bevestigden dat het systeem iPSC’s in een ongedifferentieerde toestand kon houden door verschillende passages zonder voedingscellen en differentiëren in verschillende celtypen, waaronder cardiomyocyten, hepatocyten, neurale voorlopercellen en keratinocyten. Het systeem zal zeer reproduceerbare experimenten tussen instellingen mogelijk maken zonder dat er geschoolde onderzoekers nodig zijn, en zal de sociale implementatie van hiPSC’s in een breder scala van onderzoeksgebieden vergemakkelijken door de belemmeringen voor nieuwe inzendingen te verminderen.

Introduction

Dit artikel heeft tot doel actuele en gedetailleerde behandelingsprocedures te bieden voor een geautomatiseerd kweeksysteem voor door mensen geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC), dat we hebben geproduceerd in samenwerking met een bedrijf, en om representatieve resultaten te laten zien.

Sinds de publicatie van het artikel in 2007 trekt iPSC wereldwijd de aandacht1. Vanwege de grootste eigenschap dat het in staat is om te differentiëren in elk type somatische cel, wordt verwacht dat het zal worden toegepast op verschillende gebieden, zoals regeneratieve geneeskunde, het ophelderen van de oorzaken van hardnekkige ziekten en het ontwikkelen van nieuwe therapeutische geneesmiddelen 2,3. Bovendien zou het gebruik van menselijke iPSC-afgeleide somatische cellen dierproeven kunnen verminderen, die onderworpen zijn aan aanzienlijke ethische beperkingen. Hoewel er voortdurend tal van homogene iPSC’s nodig zijn om nieuwe methoden met iPSC’s te onderzoeken, is het te omslachtig om ze te beheren. Bovendien is het hanteren van iPSC moeilijk vanwege de hoge gevoeligheid, zelfs voor subtiele culturele en omgevingsveranderingen.

Om dit probleem op te lossen, wordt van geautomatiseerde kweeksystemen verwacht dat ze taken uitvoeren in plaats van mensen. Sommige groepen hebben een paar geautomatiseerde menselijke pluripotente stamcelkweeksystemen ontwikkeld voor celonderhoud en -differentiatie en hun prestaties gepubliceerd 4,5,6. Deze systemen zijn uitgerust met multi-gelede robotarm(en). Robotarmen hebben niet alleen de verdienste dat ze menselijke armbewegingen sterk nabootsen, maar ook omdat ze hogere kosten voor de arm(en), grotere en zwaardere systeemverpakkingen en tijdrovende onderwijsinspanningen van de ingenieurs vereisen om de beoogde bewegingente verkrijgen 7,8. Om het gemakkelijker te maken om het apparaat te introduceren in meer onderzoeksfaciliteiten op de punten van economisch, ruimte- en personeelsverbruik, hebben we een nieuw geautomatiseerd kweeksysteem ontwikkeld voor het onderhoud en de differentiatie van iPSC in verschillende celtypen9.

Onze reden voor het nieuwe systeem was om een X-Y-Z-asrailsysteem te gebruiken in plaats van meervoudig gelede robotarmen9. Om de complexe handachtige functies van robotarmen te vervangen, hebben we een nieuw idee toegepast op dit systeem, dat automatisch drie soorten specifieke functionele armuiteinden kan veranderen. Hier geven we ook aan hoe gebruikers gemakkelijk taakschema’s kunnen maken met eenvoudige bestellingen op software vanwege het ontbreken van vereisten voor de bijdragen van ingenieurs gedurende het hele proces.

Een van de robotkweeksystemen heeft het maken van embryoïde lichamen gedemonstreerd met behulp van platen met 96 putjes als 3D-celaggregaten voor differentiatie4. Het hier gerapporteerde systeem kan geen platen met 96 putjes verwerken. Men bereikte de huidige good manufacturing practice (cGMP)-graad met behulp van een cellijn, hoewel het geen menselijke pluripotente stamcel was5. Het hier beschreven geautomatiseerde kweeksysteem is nu ontwikkeld met het specifieke doel om laboratoriumexperimenten te ondersteunen (figuur 1). Het heeft echter voldoende systemen om een schoon niveau te behouden dat gelijk is aan een veiligheidskast van niveau IV.

Protocol

De ethische commissie van de Kansai Medical University keurde de generatie en het gebruik goed van de gezonde, van vrijwilligers afgeleide iPSC’s genaamd KMUR001 (goedkeuring nr. 2020197). De donor, die openlijk werd gerekruteerd, gaf formele geïnformeerde toestemming en stemde in met het wetenschappelijke gebruik van de cellen. OPMERKING: De huidige interface (de speciale software met de naam “ccssHMI” die draait onder het Windows XP-besturingssysteem) is het fundamentele bedieningsscherm. O…

Representative Results

Onderhoud van door de mens geïnduceerde pluripotente stamcellenWe gebruikten drie hPSC-lijnen (RIKEN-2F, 253G1 en KMUR001). We hebben het onderhoudsprotocol geoptimaliseerd door middel van dagelijks handmatig uitgevoerde experimenten en de gedetailleerde programma’s verder geoptimaliseerd door de zeven voorbereidende experimenten die door het systeem zijn uitgevoerd. Schuifspanningen die worden veroorzaakt door de vloeistofsnelheden van de spuugstroom van verschillende pipetten die door mensen worde…

Discussion

Een cruciale stap in het protocol is dat als een gebruiker fouten vindt, u op elk gewenst moment op de knop annuleren, stoppen of resetten klikt en opnieuw begint vanaf de eerste stap. De software kan menselijke fouten voorkomen, waaronder dubbele boekingen, het openen van deuren terwijl de systeemtaken actief zijn en een gebrek aan aanvulling. Een ander cruciaal punt voor succesvolle en efficiënte differentiatie naar de gewenste somatische cel is de juiste selectie van pluripotente stamcellijnen, omdat elke pluripotent…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Deze studie werd ondersteund door een subsidie van het New Business Promotion Center, Panasonic Production Engineering Co., Ltd., Osaka, Japan.

Materials

0.15% bovine serum albumin fraction V Fuji Film Wako Chemical Inc., Miyazaki, Japan 9048-46-8
1% GlutaMAX Thermo Fisher Scientific 35050061
10 cm plastic plates  Corning Inc., NY, United States 430167
253G1 RKEN Bioresource Research Center HPS0002
2-mercaptoethanol Thermo Fisher Scientific 21985023
Actinin  mouse Abcam ab9465
Activin A  Nacali Tesque 18585-81
Adenine Thermo Fisher Scientific A14906.30
Albumin  rabbit Dako A0001
All-trans retinoic acid Fuji Film Wako Chemical Inc.  186-01114
Automated culture system Panasonic
B-27 supplement Thermo Fisher Scientific 17504044
bFGF Fuji Film Wako Chemical Inc.  062-06661
BMP4  Thermo Fisher Scientific PHC9531
Bovine serum albumin Merck 810037
CHIR-99021  MCE, NJ, United States #HY-10182 252917-06-9
Defined Keratinocyte-SFM Thermo Fisher Scientific 10744019 Human keratinocyte medium
Dexamethasone Merck 266785
Dihexa  TRC, Ontario, Canada 13071-60-8 rac-1,2-Dihexadecylglycerol
Disposable hemocytometer CountessTM Cell Counting Chamber Slides, Thermo Fisher Scientific C10228
Dorsomorphin Thermo Fisher Scientific 1219168-18-9
Dulbecco’s modified Eagle medium/F12  Fuji Film Wako Chemical Inc. 12634010
EGF Fuji Film Wako Chemical Inc.  053-07751
Essential 8  Thermo Fisher Scientific A1517001 Human pluripotent stem cell medium
Fetal bovine serum  Biowest, FL, United States S140T
FGF-basic  Nacalai Tesque Inc. 19155-07
Forskolin Thermo Fisher Scientific J63292.MF
Glutamine Thermo Fisher Scientific 25030081 Glutamine supplement
Goat IgG(H+L) AlexaFluo546 Thermo Scientific A11056
HNF-4A  goat Santacruz 6556
Hydrocortisone Thermo Fisher Scientific A16292.06
Hydrocortisone 21-hemisuccinate Merck H2882
iMatrix511 Silk  Nippi Inc., Tokyo, Japan 892 021 Cell culture matrix
Insulin-transferrin-selenium Thermo Fisher Scientific 41400045
Keratin 1  mouse Santacruz 376224
Keratin 10  rabbit BioLegend 19054
KMUR001 Kansai Medical University  Patient-derived iPSCs 
Knockout serum replacement Thermo Fisher Scientific 10828010
L-ascorbic acid 2-phosphate  A8960, Merck A8960
Leibovitz’s L-15 medium  Fuji Film Wako Chemical Inc. 128-06075
Matrigel Corning Inc. 354277
Mouse IgG(H+L) AlexaFluo488 Thermo Scientific A21202
N-2 supplement Thermo Fisher Scientific 17502048
Nestin mouse Santacruz 23927
Neurobasal medium Thermo Fisher Scientific 21103049
Neurofilament  rabbit Chemicon AB1987
Neutristem Sartrius AG, Göttingen, Germany 05-100-1A cell culture medium 
Oct 3/4  mouse BD 611202
PBS(-) Nacalai Tesque Inc., Kyoto, Japan 14249-24
Rabbit IgG(H+L) AlexaFluo488 Thermo Scientific A21206
Rabbit IgG(H+L) AlexaFluo546 Thermo Scientific A10040
Recombinant human albumin  A0237, Merck, Darmstadt, Germany A9731
Rho kinase inhibitor, Y-27632  Sellec Inc., Tokyo, Japan 129830-38-2
RIKEN 2F RKEN Bioresource Research Center HPS0014 undifferentiated hiPSCs 
RPMI 1640  Thermo Fisher Scientific #11875 12633020
SB431542 Thermo Fisher Scientific 301836-41-9
Sodium L-ascorbate Merck A4034-100G
SSEA-4  mouse Millipore MAB4304
StemFit AK02N  Ajinomoto, Tokyo, Japan AK02 cell culture medium 
TnT rabbit Abcam ab92546
TRA 1-81 mouse Millipore MAB4381
Triiodothyronine Thermo Fisher Scientific H34068.06
TripLETM express enzyme  Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, United States 12604013
Trypan blue solution  Nacalai Tesque, Kyoto, Japan 20577-34
Tryptose phosphate broth Merck T8782-500G
Wnt-C59  Bio-techne, NB, United Kingdom 5148
β Equation 1 Tublin  mouse Promega G712A

Referências

  1. Okita, K., et al. A more efficient method to generate integration-free human iPS cells. Nature Methods. 8 (5), 409-412 (2011).
  2. Tanaka, T., et al. In vitro pharmacologic testing using human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Biochemical and Biophysical Research Communications. 385 (4), 497-502 (2009).
  3. Egashira, T., et al. Disease characterization using LQTS-specific induced pluripotent stem cells. Cardiovascular Research. 95 (4), 419-429 (2012).
  4. Sasamata, M., et al. Establishment of a robust platform for induced pluripotent stem cell research using Maholo LabDroid. SLAS technology. 26 (5), 441-453 (2021).
  5. Tristan, C. A., et al. Robotic high-throughput biomanufacturing and functional differentiation of human pluripotent stem cells. Stem Cell Reports. 16 (12), 3076-3092 (2021).
  6. Konagaya, S., Ando, T., Yamauchi, T., Suemori, H., Iwata, H. Long-term maintenance of human induced pluripotent stem cells by automated cell culture system. Scientific Reports. 5, 16647 (2015).
  7. McClymont, D. W., Freemont, P. S. With all due respect to Maholo, lab automation isn’t anthropomorphic. Nature Biotechnology. 35 (4), 312-314 (2017).
  8. Gonzalez, F., Zalewski, J. Teaching joint-level robot programming with a new robotics software tool. Robotics. 6 (4), 41 (2017).
  9. Bando, K., Yamashita, H., Tsumori, M., Minoura, H., Okumura, K., Hattori, F. Compact automated culture system for human induced pluripotent stem cell maintenance and differentiation. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 10, 1074990 (2022).
  10. Tohyama, S., et al. Glutamine oxidation is indispensable for survival of human pluripotent stem cells. Cell Metabolism. 23 (4), 663-674 (2016).
  11. Yamashita, H., Fukuda, K., Hattori, F. Hepatocyte-like cells derived from human pluripotent stem cells can be enriched by a combination of mitochondrial content and activated leukocyte cell adhesion molecule. JMA journal. 2 (2), 174-183 (2019).
  12. Shimojo, D., et al. Rapid, efficient and simple motor neuron differentiation from human pluripotent stem cells. Molecular Brain. 8 (1), 79 (2015).
  13. Nishimoto, R., Kodama, C., Yamashita, H., Hattori, F. Human induced pluripotent stem cell-derived keratinocyte-like cells for research on Protease-Activated Receptor 2 in nonhistaminergic cascades of atopic dermatitis. The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 384 (2), 248-253 (2023).
  14. International Stem Cell Initiative. Screening ethnically diverse human embryonic stem cells identifies a chromosome 20 minimal amplicon conferring growth advantage. Nature Biotechnology. 29 (12), 1132-1144 (2011).
  15. Keller, A., et al. Genetic and epigenetic factors which modulate differentiation propensity in human pluripotent stem cells. Human Reproduction Update. 24 (2), 162-175 (2018).

Play Video

Citar este artigo
Bando, K., Yamashita, H., Hattori, F. An Automated Culture System for Maintaining and Differentiating Human-Induced Pluripotent Stem Cells. J. Vis. Exp. (203), e65672, doi:10.3791/65672 (2024).

View Video