Summary

Drenerende lymfeknutemetastasemodell for å vurdere dynamikken til antigenspesifikke CD8+ T-celler under tumorigenese

Published: January 26, 2024
doi:

Summary

Den eksperimentelle designen som presenteres her gir en nyttig reproduksjonsmodell for studier av antigenspesifikke CD8+ T-celler under lymfeknute (LN) metastase, som utelukker forstyrrelse av tilskuer-CD8+ T-celler.

Abstract

Tumorantigenspesifikke CD8+ T-celler fra drenerende lymfeknuter får en akkumulerende betydning ved montering av antitumorimmunrespons under tumorigenese. Imidlertid danner kreftceller i mange tilfeller metastatiske loci i lymfeknuter før de metastaserer videre til fjerne organer. I hvilken grad de lokale og systematiske CD8+ T-celleresponsene ble påvirket av LN-metastase, er fortsatt uklart. For dette formål satte vi opp en murine LN-metastasemodell kombinert med en B16F10-GP melanomcellelinje som uttrykker surrogatneoantigenet avledet fra lymfocytisk choriomeningittvirus (LCMV), glykoprotein (GP) og P14 transgene mus som har T-cellereseptorer (TCR) som er spesifikke for GP-avledet peptid GP33-41 presentert av klasse I store histokompatibilitetskompleks (MHC) molekyl H-2Db. Denne protokollen gjør det mulig å studere antigenspesifikke CD8+ T-celleresponser under LN-metastase. I denne protokollen ble C57BL/6J-mus subkutant implantert med B16F10-GP-celler, etterfulgt av adoptivoverføring med naive P14-celler. Da subkutan tumor vokste til ca. 5 mm i diameter, ble primærtumor skåret ut, og B16F10-GP-celler ble injisert direkte i tumordrenerende lymfeknute (TdLN). Deretter ble dynamikken til CD8 + T-celler overvåket under prosessen med LN-metastase. Samlet har denne modellen gitt en tilnærming til nøyaktig å undersøke de antigenspesifikke CD8 + T-celleimmunresponsene under LN-metastase.

Introduction

Kreftimmunterapi, spesielt immunsjekkpunktblokaden (ICB), har revolusjonert kreftbehandling1. ICB blokkerer de koinhibitoriske immunreseptorene (som PD-1, Tim-3, LAG-3 og TIGIT), som er sterkt uttrykt i utmattede CD8 + T-celler i tumormikromiljøet (TME), noe som fører til gjenopplivning av utmattede CD8 + T-celler2. Tatt i betraktning heterogeniteten til utmattede CD8 + T-celler, viste akkumulerende bevis at tumorspesifikke CD8 + T-celler avledet fra periferien, inkludert drenering av lymfeknute (dLN), men ikke i TME, medierer effekten av ICB 3,4,5,6,7,8. Nylig ble TdLN-avledede TCF-1 + TOX-tumorspesifikke CD8 + T-celler (TdLN-TTSM) bekreftet å være de ekte responderne på ICB som legemliggjør flere funksjonelle egenskaper til konvensjonelle minne T-celler og kan ytterligere utvide og differensiere til avkom, utmattede celler ved ICB-behandling9. Samlet sett bekreftet disse funnene betydningen av LN i montering av antitumorimmunitet.

Lymfeknute fungerer som et kritisk sted for å lette priming og aktivering av tumorspesifikke CD8 + T-celler ved å gi strukturelt grunnlag så vel som biologiske signaler10. Flere typer kreftceller frø ofte vaktpostlymfeknute (SLN, den første LN som drenerer en primærtumor) før systematisk spredning11. Tilstedeværelsen av SLN-metastase er knyttet til dårlig utfall i human kreft, og prekliniske modeller viste at tumorceller i TdLN kunne spre seg til fjerne organer gjennom både lymfekar og blodkar i noden 12,13,14,15. SLN-biopsi representerer nå en standardprosedyre for å veilede etterfølgende behandlingsbeslutninger i mange solide tumortyper som kan unngå unødvendig reseksjon av uinvolvert LN16,17. Selv for den involverte LN er det fortsatt kontroversielt om og når kirurgisk reseksjon er nødvendig, da flere studier har vist at fjerning av regional LN ikke viste forbedret totaloverlevelse sammenlignet med de som fikk stråling eller systemisk behandling uten regional LN-reseksjon 18,19. En tolkning er at metastatisk LN (mLN) med mikroskopisk sykdom kan beholde en viss kapasitet til å utdanne immunceller og gi noen terapeutiske fordeler. Så det er kritisk viktig å belyse hvordan LN-metastase påvirker antitumorimmunresponsen, spesielt egenskapene og funksjonene til TdLN-TTSM.

Hittil har både prekliniske og kliniske data avslørt noen strukturelle og cellulære endringer i mLN20. Imidlertid er de dynamiske endringene av tumorspesifikke CD8 + T-celler under LN-metastase ikke avgrenset. Derfor er det nødvendig å utvikle en overbevisende modell for LN-metastase for videre undersøkelse. Faktisk har flere studier rapportert mLN musemodeller på forskjellige måter 14,21,22. For eksempel ble spontan metastase i aksillære LN utført ved implantasjon av 4T1 brystkreftceller i brystfettputen22. I en annen studie genererte Reticker-Flynn et al. melanomcellelinjer med høy forekomst av spredning fra subkutan primærtumor til LN gjennom seriell inokulering av tumorceller dyrket fra dissosiert mLN-vev (ni runder)14. En annen vanlig modell ble utarbeidet ved injeksjon av tumorceller i fotputen, og metastatiske loci ville bli dannet i popliteal LN22. Spesielt er det vanskelig å evaluere de nøyaktige tidspunktene for intervensjon fordi LN-metastase i disse modellene ikke alltid er trofast.

I denne studien ble en murine LN-metastatisk modell etablert gjennom intranodal injeksjon av B16F10-GP-celler23,24, generert ved CRISPR/Cas9-mediert innsetting av LCMV-virusglykoprotein (GP) gensekvens i genomet til B16F10-cellelinje9. Deretter ble disse musene overført med P14-celler som har transgene T-cellereseptorer (TCR) som spesifikt gjenkjenner H-2Db GP33-41-epitopen 25,26 og den systemiske og lokale dynamikken til antigenspesifikke CD8 + T-celler under LN-metastase kunne undersøkes. Vår eksperimentelle design gir en nyttig modell for studiet av immunresponser, spesielt de antigenspesifikke CD8 + T-cellene under LN-metastasen som utelukker forstyrrelsen av tilskuer-CD8 + T-celler. Disse resultatene vil påvirke de kliniske behandlingsalternativene for å fjerne eller beholde mLN og kaste nytt lys over manipulering av mLN for å oppnå maksimal terapeutisk nytte.

Protocol

C57BL/6J-musene (referert til B6-mus) og naive P14-transgene mus 9,27 som ble brukt var 6-10 ukers alder som veide 18-22 g. Både mann og kvinne ble inkludert uten randomisering eller blinding. Alle dyreforsøk ble utført i samsvar med retningslinjene fra Institutional Animal Care and Use Committee ved Qingdao Agricultural University. 1. Fremstilling av medium og reagenser Forbered B16F10-GP melanom cellekul…

Representative Results

Det skjematiske diagrammet til dette eksperimentelle designet er vist i figur 1A. Totalt 5 x 105 B16F10-GP-celler i 100 μL PBS ble subkutant (s.c.) implantert i den bilaterale lyskeregionen av CD45.2 C57BL/6J-mus. Etter 7 dager ble disse tumorbærende musene intraperitonealt (i.p.) injisert med 4 mg CTX, etterfulgt av adoptivoverføring av 5 x 105 CD45.1 + P14-celler gjennom intravenøs injeksjon i halen. Ved tumorvekst til ca. 3-5 mm i diameter (ca. 7 dager…

Discussion

Under tumorigenese sluker antigenpresenterende celler (APCer) tumorantigener og migrerer til TdLN hvor de primer CD8 + T-celler. Etter priming og aktivering forlater CD8 + T-celler TdLN og infiltrerer svulsten for å drepe tumorceller10. Gjennom TdLN-reseksjon og administrering av FTY720 som blokkerer utgangen av immunceller fra lymfoide organer, har flere studier vist den sentrale rollen til TdLN for å sikre effekten av PD-1 / PD-L1 sjekkpunktbehandling34,…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dette arbeidet ble støttet av National Science Foundation for Outstanding Young Scholars of China (nr. 82122028 til LX), National Natural Science Foundation of China (nr. 82173094 til LX), Natural Science Foundation of Chong Qing (nr. 2023NSCQ-BHX0087 til SW).

Materials

1.5 mL centrifuge tube KIRGEN KG2211
100 U insulin syringe BD Biosciences  320310
15 mL conical tube  BEAVER  43008
2,2,2-Tribromoethanol (Avertin)  Sigma  T48402-25G 
2-Methyl-2-butanol Sigma 240486-100ML 
70 μm nylon cell strainer BD Falcon  352350
APC anti-mouse CD45.1  BioLegend  110714 Clone:A20 
B16-GP cell line Beijing Biocytogen Co.Ltd, China Custom
BSA-V (bovine serum albumin)  Bioss bs-0292P
cell culture dish BEAVER  43701/43702/43703 
centrifuge Eppendorf 5810R-A462/5424R 
cyclophosphamide Sigma  C0768-25G 
Cyclophosphamide (CTX) Sigma PHR1404
Dulbecco's Modified Eagle Medium  Gibco  C11995500BT 
EDTA Sigma EDS-500g 
FACS tubes BD Falcon 352052
fetal bovine serum  Gibco 10270-106
flow cytometer BD FACSCanto II
hemocytometer PorLab Scientific HM330
isoflurane RWD life science  R510-22-16 
KHCO3  Sangon Biotech  A501195-0500 
LIVE/DEAD Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit, for 633 or 635 nm excitation  Life Technologies  L10199 
needle carrier  RWD Life Science  F31034-14 
NH4Cl  Sangon Biotech A501569-0500 
paraformaldehyde Beyotime P0099-500ml 
PE anti-mouse TCR Vα2 BioLegend 127808 Clone:B20.1 
Pen Strep Glutamine (100x) Gibco 10378-016
PerCP/Cy5.5 anti-mouse CD8a  BioLegend 100734 Clone:53-6.7
RPMI-1640 Sigma R8758-500ML
sodium azide Sigma S2002 
surgical forceps RWD Life Science  F12005-10
surgical scissors RWD Life Science  S12003-09 
suture thread RWD Life Science F34004-30 
trypsin-EDTA Sigma T4049-100ml

Referências

  1. Morad, G., Helmink, B. A., Sharma, P., Wargo, J. A. Hallmarks of response, resistance, and toxicity to immune checkpoint blockade. Cell. 184 (21), 5309-5337 (2021).
  2. Korman, A. J., Garrett-Thomson, S. C., Lonberg, N. The foundations of immune checkpoint blockade and the ipilimumab approval decennial. Nat Rev Drug Discov. 21 (7), 509-528 (2022).
  3. Chamoto, K., et al. Mitochondrial activation chemicals synergize with surface receptor PD-1 blockade for T cell-dependent antitumor activity. Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (5), E761-E770 (2017).
  4. Spitzer, M. H., et al. Systemic immunity is required for effective cancer immunotherapy. Cell. 168 (3), 487-502 (2017).
  5. Yost, K. E., et al. Clonal replacement of tumor-specific T cells following PD-1 blockade. Nat Med. 25 (8), 1251-1259 (2019).
  6. Wu, T. D., et al. Peripheral T cell expansion predicts tumour infiltration and clinical response. Nature. 579 (7798), 274-278 (2020).
  7. Connolly, K. A., et al. A reservoir of stem-like cd8(+) t cells in the tumor-draining lymph node preserves the ongoing antitumor immune response. Sci Immunol. 6 (64), eabg7836 (2021).
  8. Schenkel, J. M., et al. Conventional type I dendritic cells maintain a reservoir of proliferative tumor-antigen specific Tcf-1+ CD8+ T cells in tumor-draining lymph nodes. Immunity. 54 (10), 2338-2353 (2021).
  9. Huang, Q., et al. The primordial differentiation of tumor-specific memory cd8(+) t cells as bona fide responders to pd-1/pd-l1 blockade in draining lymph nodes. Cell. 185 (22), 4049-4066 (2022).
  10. Kanda, Y., Okazaki, T., Katakai, T. Motility dynamics of T cells in tumor-draining lymph nodes: A rational indicator of antitumor response and immune checkpoint blockade. Cancers (Basel). 13 (18), 4616 (2021).
  11. Karaman, S., Detmar, M. Mechanisms of lymphatic metastasis. J Clin Invest. 124 (3), 922-928 (2014).
  12. Pereira, E. R., et al. Lymph node metastases can invade local blood vessels, exit the node, and colonize distant organs in mice. Science. 359 (6382), 1403-1407 (2018).
  13. Brown, M., et al. Lymph node blood vessels provide exit routes for metastatic tumor cell dissemination in mice. Science. 359 (6382), 1408-1411 (2018).
  14. Reticker-Flynn, N. E., et al. Lymph node colonization induces tumor-immune tolerance to promote distant metastasis. Cell. 185 (11), 1924-1942 (2022).
  15. Leong, S. P., et al. Impact of nodal status and tumor burden in sentinel lymph nodes on the clinical outcomes of cancer patients. J Surg Oncol. 103 (6), 518-530 (2011).
  16. Lyman, G. H., et al. Sentinel lymph node biopsy for patients with early-stage breast cancer: American society of clinical oncology clinical practice guideline update. J Clin Oncol. 35 (5), 561-564 (2017).
  17. Wong, S. L., et al. Sentinel lymph node biopsy and management of regional lymph nodes in melanoma: American society of clinical oncology and society of surgical oncology clinical practice guideline update. Ann Surg Oncol. 25 (2), 356-377 (2018).
  18. Faries, M. B., et al. Completion dissection or observation for sentinel-node metastasis in melanoma. N Engl J Med. 376 (23), 2211-2222 (2017).
  19. Giuliano, A. E., et al. Effect of axillary dissection vs no axillary dissection on 10-year overall survival among women with invasive breast cancer and sentinel node metastasis: The ACOSOG Z0011 (alliance) randomized clinical trial. JAMA. 318 (10), 918-926 (2017).
  20. du Bois, H., Heim, T. A., Lund, A. W. Tumor-draining lymph nodes: At the crossroads of metastasis and immunity. Sci Immunol. 6 (63), eabg3551 (2021).
  21. An, S., et al. Locally trapping the c-c chemokine receptor type 7 by gene delivery nanoparticle inhibits lymphatic metastasis prior to tumor resection. Small. 15 (9), e1805182 (2019).
  22. Lee, C. K., et al. Tumor metastasis to lymph nodes requires yap-dependent metabolic adaptation. Science. 363 (6427), 644-649 (2019).
  23. Buchwald, Z. S., et al. Tumor-draining lymph node is important for a robust abscopal effect stimulated by radiotherapy. J ImmunoTher Cancer. 8 (2), e000867 (2020).
  24. Siddiqui, I., et al. Intratumoral Tcf1+PD-1+CD8+ T cells with stem-like properties promote tumor control in response to vaccination and checkpoint blockade immunotherapy. Immunity. 50 (1), 195.e10-211.e10 (2019).
  25. Ashton-Rickardt, P. G., et al. Evidence for a differential avidity model of T cell selection in the thymus. Cell. 76 (4), 651-663 (1994).
  26. Manjunath, N., et al. Effector differentiation is not prerequisite for generation of memory cytotoxic T lymphocytes. J Clin Invest. 108 (6), 871-878 (2001).
  27. Khan, O., et al. TOX transcriptionally and epigenetically programs CD8+ T cell exhaustion. Nature. 571 (7764), 211-218 (2019).
  28. North, R. J. Cyclophosphamide-facilitated adoptive immunotherapy of an established tumor depends on elimination of tumor-induced suppressor T cells. J Exp Med. 155 (4), 1063-1074 (1982).
  29. Maine, G. N., Mule, J. J. Making room for T cells. J Clin Invest. 110 (2), 157-159 (2002).
  30. Xue, G., et al. Adoptive cell therapy with tumor-specific th9 cells induces viral mimicry to eliminate antigen-loss-variant tumor cells. Cancer Cell. 39 (12), 1610.e9-1622.e9 (2021).
  31. Prokhnevska, N., et al. CD8+ T cell activation in cancer comprises an initial activation phase in lymph nodes followed by effector differentiation within the tumor. Immunity. 56 (1), 107.e5-124.e5 (2023).
  32. Wang, L., et al. Tumor transplantation for assessing the dynamics of tumor-infiltrating CD8+ T cells in mice. J Vis Exp. (172), e62442 (2021).
  33. Liu, Q., et al. Tumor-specific memory cd8(+) t cells are strictly resident in draining lymph nodes during tumorigenesis. Cell Mol Immunol. 20 (4), 423-426 (2023).
  34. Fransen, M. F., et al. Tumor-draining lymph nodes are pivotal in pd-1/pd-l1 checkpoint therapy. JCI Insight. 3 (23), e124507 (2018).
  35. Francis, D. M., et al. Blockade of immune checkpoints in lymph nodes through locoregional delivery augments cancer immunotherapy. Sci Transl Med. 12 (563), eaay3575 (2020).
  36. Garner, H., de Visser, K. E. Immune crosstalk in cancer progression and metastatic spread: A complex conversation. Nat Rev Immunol. 20 (8), 483-497 (2020).

Play Video

Citar este artigo
Zhang, Y., Su, X., Wang, L., Yue, Z., Liu, Q., Ran, L., Lei, S., Hu, J., Xu, L., Ye, L., Ji, P., Li, G., Huang, Q., Wen, S. Draining Lymph Node Metastasis Model for Assessing the Dynamics of Antigen-Specific CD8+ T Cells During Tumorigenesis. J. Vis. Exp. (203), e65646, doi:10.3791/65646 (2024).

View Video