Summary

Lebendzell-Bildgebung von Drosophila melanogaster im dritten Stadium des Larvengehirns

Published: June 23, 2023
doi:

Summary

Hier diskutieren wir einen Arbeitsablauf zur Präparation, Sektion, Montage und Bildgebung von lebenden Explantatgehirnen aus Drosophila melanogaster-Larven des dritten Stadiums, um die zelluläre und subzelluläre Dynamik unter physiologischen Bedingungen zu beobachten.

Abstract

Drosophila-neurale Stammzellen (Neuroblasten, im Folgenden NBs) durchlaufen asymmetrische Teilungen, die den sich selbst erneuernden Neuroblasten regenerieren und gleichzeitig eine differenzierende Ganglienmutterzelle (GMC) bilden, die eine zusätzliche Teilung durchläuft, um zwei Neuronen oder Gliazellen entstehen zu lassen. Studien an NBs haben die molekularen Mechanismen aufgedeckt, die der Zellpolarität, der Spindelorientierung, der Selbsterneuerung neuraler Stammzellen und der Differenzierung zugrunde liegen. Diese asymmetrischen Zellteilungen sind durch Lebendzell-Bildgebung leicht zu beobachten, wodurch sich Larven-NBs ideal für die Untersuchung der räumlich-zeitlichen Dynamik der asymmetrischen Zellteilung in lebendem Gewebe eignen. Bei richtiger Präparation und Abbildung in nährstoffangereichertem Medium teilen sich NBs im Explantatgehirn 12-20 Stunden lang robust. Die zuvor beschriebenen Methoden sind technisch schwierig und können für Neulinge auf diesem Gebiet eine Herausforderung darstellen. Hier wird ein Protokoll für die Präparation, Präparation, Montage und Bildgebung von lebenden Larvenexplantaten des dritten Stadiums unter Verwendung von Fettkörperpräparaten beschrieben. Es werden auch mögliche Probleme diskutiert und Beispiele für den Einsatz dieser Technik gegeben.

Introduction

Asymmetrische Zellteilung (ACD) ist der Prozess, bei dem subzelluläre Komponenten wie RNA, Proteine und Organellen ungleichmäßig auf die Tochterzellen verteilt werden 1,2. Dieser Prozess ist häufig bei Stammzellen zu beobachten, die ACD durchlaufen, um Tochterzellen mit unterschiedlichen Entwicklungsschicksalen hervorzubringen. Drosophila NBs teilen sich asymmetrisch und erzeugen eine NB, die ihre Stammform beibehält, und eine Ganglienmutterzelle (GMC). Das GMC durchläuft weitere Teilungen, um differenzierende Neuronen oder Gliazellenzu erzeugen 3. Asymmetrisch teilende NBs sind in den sich entwickelnden Gehirnen von Larven des dritten Stadiums reichlich vorhanden, die mit Hilfe der Mikroskopie leicht beobachtet werden können. Im Larvenstadium des dritten Stadiums sind in jedem zentralen Hirnlappen etwa 100 NBsvorhanden 3,4,5,6.

Die asymmetrische Zellteilung ist ein hochdynamischer Prozess. Lebendzell-Bildgebungsprotokolle wurden verwendet, um die Dynamik der Zellpolarität 7,8,9,10, der Spindelorientierung 11,12,13, der Dynamik des Aktomyosin-Kortex14,15,16,17,18, der Mikrotubuli- und Zentrosombiologie 19,20 zu messen und zu quantifizieren,21,22,23,24,25,26,27 und Membran 10,28 und Chromatindynamik 29. Qualitative und quantitative Beschreibungen von ACD basieren auf robusten Methoden und Protokollen, um NBs in intakten lebenden Gehirnen abzubilden. Das folgende Protokoll beschreibt Methoden zur Präparation, Sektion und Bildgebung von Larvengehirnen im dritten Stadium für die Bildgebung lebender Zellen in vivo unter Verwendung von zwei verschiedenen Montageansätzen. Diese Methoden eignen sich am besten für Forscher, die sich für die raumzeitliche Dynamik von Stammzellteilungen sowie für Teilungen in anderen Gehirnzellen interessieren, da sie kurz- und langfristige Beobachtungen zellulärer Ereignisse ermöglichen. Darüber hinaus sind diese Techniken für Neulinge auf diesem Gebiet leicht zugänglich. Wir demonstrieren die Effektivität und Anpassungsfähigkeit dieses Ansatzes mit Larvenhirnen, die fluoreszenzmarkierte Mikrotubuli und kortikale Fusionsproteine exprimieren. Darüber hinaus diskutieren wir Analysemethoden und Überlegungen zur Anwendung in anderen Studien.

Protocol

HINWEIS: Abbildung 1 zeigt die Materialien, die für die Durchführung dieser Studie erforderlich sind. 1. Überlegungen und Vorbereitungen für das Experiment Verhindern Sie, dass sich die Larven überfüllen.HINWEIS: Die Qualität der Larvengehirne steht in direktem Zusammenhang mit der Gesundheit und Qualität der Larven vor der Sektion. Larven, die durch Überfüllung unterernährt sind, bringen im Allgemeinen Gehirne von geringe…

Representative Results

Dissektion und Bildgebung von zentralen Hirnlappen-NBs, die Pins::EGFP und Cherry::Jupiter exprimierenUm dieses Protokoll zu demonstrieren, wurden Larven, die UAS-getriebenes Cherry::Jupiter13 exprimieren und endogen mit Pins::EGFP16 markiert sind (w; worGal4, UAS-cherry::jupiter/CyO; Die Pins::EGFP/TM6B, Tb) wurden 4 h lang mit dem beschriebenen Protokoll unter Verwendung von Multi-Well-Imaging-Objektträgern abgebildet (<strong class=…

Discussion

Dieses Protokoll beschreibt einen Ansatz für die Bildgebung von lebenden Explantatgehirnen aus Drosophila melanogaster-Larven . Das hier beschriebene Protokoll erlaubt es, Explantatgehirne für 12-20 Stunden unter den richtigen experimentellen Bedingungen zu beobachten. Besonderes Augenmerk muss auf die Vorbereitung der Proben und das Design der gewünschten Experimente gelegt werden. Wie bereits erwähnt, ist einer der kritischsten Faktoren, der die Qualität des präparierten Gewebes bestimmt, die Gesundheit …

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Forschung wird durch R35GM148160 (C. C.) und einen National Institutes of Health (NIH) Training Grant T32 GM007270 (R. C. S) unterstützt

Materials

0.22 µm polyethersulfone (PES) Membrane Genesee 25-231 Vacuum-driven filters
Agar Genesee 20-248 granulated agar
Analytical Computer Dell NA Intel Xeon Gold 5222 CPU with two 3.80 GHz processors running Windows 10 on a 64-bit operating system
Bovine Growth Serum HyClone SH30541.02
Chambered Imaging Slides Ibidi 80826
Confocal Microscope Nikon NA
Custom-machined metal slide NA NA See Cabernard and Doe 2013 (Ref. 34) for specifications
Dissection Dishes Fisher Scientific 5024343 3-well porcelain micro spot plate
Dissection Forceps World Precision Instruments Dumont #5
Dissection Microscope Leica NA
Dissection Scissors Fine Science Tools (FST) 15003-08
Embryo collection cage Genesee 59-100
Flypad with access to CO2 to anesthetize adult flies Genesee 59-172
Gas-permeable membrane YSI 98095 Gas-permeable membrane
Glass Cover Slides Electron Microscopy Sciences 72204-03 # 1.5; 22 mm x 40 mm glass coverslips
Imaris Oxford Instruments NA Alternatives: Fiji, Volocity, Aivia
Imaris File Converter Oxford Instruments NA
Instant Yeast Saf-Instant NA
Molasses Genesee 62-117
Petri dish Greiner Bio-One 628161 60 mm x 15 mm Petri dish
Petroleum Jelly Vaseline NA
Schneider's Insect Medium with L-glutamine and sodium bicarbonate liquid Millipore Sigma S0146
SlideBook acquisition software 3i NA
Vacuum-Driven Filtration Unit with a 0.22 µµm PES membrane filter Genesee Scientific, GenClone 25-231

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Citar este artigo
Segura, R. C., Cabernard, C. Live-Cell Imaging of Drosophila melanogaster Third Instar Larval Brains. J. Vis. Exp. (196), e65538, doi:10.3791/65538 (2023).

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