影响眼睛视网膜色素上皮层的退行性眼病具有单基因和多基因起源。已经开发了几种疾病模型和软件应用程序LipidUNet来研究疾病的机制以及潜在的治疗干预措施。
视网膜色素上皮(RPE)是位于眼睛后部的单层六角形细胞。它为光感受器和脉络膜毛细血管提供营养和支持,对感光器外段(POS)进行吞噬作用,并以极化方式分泌细胞因子以维持外视网膜的稳态。由突变、衰老和环境因素引起的功能失调的 RPE 会导致其他视网膜层退化并导致视力丧失。退化 RPE 的一个标志性表型特征是细胞内和亚细胞内富含脂质的沉积物。这些沉积物是不同视网膜退行性疾病的共同表型。为了在 体外重现单基因视网膜变性的脂质沉积表型,从患者的成纤维细胞中产生了诱导多能干细胞衍生的RPE(iRPE)。Stargardt和迟发性视网膜变性(L-ORD)患者产生的细胞系用POS喂养7天以复制RPE生理功能,这在这些疾病中引起了POS吞噬诱导的病理。为了生成年龄相关性黄斑变性(AMD)的模型,这是一种与替代补体激活相关的多基因疾病,iRPE受到替代补体过敏毒素的挑战。使用尼罗河红、硼-二吡咯甲烷(BODIPY)和载脂蛋白E(APOE)对细胞内和亚细胞脂质沉积物进行了表征。为了量化脂质沉积物的密度,开发了一种基于机器学习的软件LipidUNet。该软件在培养表面上对iRPE的最大强度投影图像进行了训练。将来,它将被训练来分析三维(3D)图像并量化脂滴的体积。LipidUNet软件将成为发现减少疾病模型中脂质积累的药物的宝贵资源。
视网膜色素上皮(RPE)是位于眼睛后部与视网膜感光器相邻的单层细胞。RPE通过为光感受器提供代谢和结构支持,在维持正常视力方面起着至关重要的作用。健康的RPE细胞具有独特的六边形形态。它们通过紧密的连接连接,这使得RPE能够充当位于其基底侧的绒毛细血管和位于顶端的光感受器之间的屏障。为了维持视网膜生态系统,RPE 将关键代谢物(例如葡萄糖)运送到光感受器,以最大限度地减少 RPE 中的葡萄糖消耗1。由于这种限制,RPE依赖于其他代谢物来维持其代谢需求,包括脂肪酸,RPE通过β氧化将其转化为酮2。鉴于 RPE 倾向于利用脂肪酸(可能从感光器外段 (POS) 消化中回收)作为能量来源,RPE 中脂质加工途径的有害变化通常会导致或与单基因和多基因退行性视网膜疾病有关3。
年龄相关性黄斑变性(AMD)是一种导致RPE变性的多基因退行性眼病,也与RPE单层中的异常自噬和脂质代谢有关。功能失调的RPE单层无法处理POS和执行其他关键功能,导致细胞外(亚RPE)沉积,称为基础线性沉积物(BLinD),位于RPE和Bruch膜之间 – 这是AMD病理学的标志。BLinD的主要成分包括脂蛋白,其中最丰富的是载脂蛋白E(APOE)4。BLinD薄层的积累会导致软玻璃膜疣,这被认为是AMD5,6的临床症状。
一些小组已经表明,导致RPE功能障碍的干细胞衍生体外疾病模型具有亚RPE脂质积累7,8,9。Hallam等人(2017)由于CFH基因的多态性,从AMD高风险患者中产生了诱导多能干细胞衍生的RPE(iRPE)。iRPE显示玻璃膜疣积累,如APOE为标志,高风险RPE积累的沉积物大于低风险患者产生的iRPE10。
为了创建一个体 外 模型来概括AMD的细胞特征,如脂滴和玻璃膜疣沉积,使用先前发表的发育指导方案11建立了从患者血液样本生成的iRPE系。iRPE接受补体感受能力人血清(CC-HS),这是一种含有过敏毒素的溶液,模仿AMD的一个可能原因:增加替代补体信号传导8。使用常用的脂质和脂蛋白标记物APOE,尼罗河红和BODIPY测量产生的脂质沉积物的细胞和亚细胞沉积。通过这些标记物,显示通过CC-HS激活的补体信号传导加剧了iRPE细胞中的脂质积累8。
为了开发单基因视网膜退行性疾病的疾病模型,从Stargardt病患者开发了iRPE系,Stargardt病是一种由RPE中 ABCA4 基因突变引起的疾病。先前已经表明,当 ABCA4 被敲除时,A2E脂褐素(一种已知含有高水平磷脂和光依赖性脂质过氧化产物的细胞内沉积物)积聚在RPE12内。 ABCA4 敲除线与患者线一起开发,并且两者都经过 POS 喂养。Stargardt iRPE显示出POS吞噬作用诱导的病理学,表现出通过BODIPY染色定量的脂质积累增加。来源于 ABCA4 KO iPSCs的RPE进行CC-HS处理;BODIPY信号的定量显示Stargardt病模型中脂质处理存在缺陷9。
鉴于这些疾病的流行和对有效疗法的需求,以及上述相关疾病模型,有必要建立强有力的方法来量化潜在治疗的疗效。为了以客观、自动化和标准化的方式量化脂质沉积,我们创建了一个基于机器学习的软件 LipidUNet,以便与掩模分析工具配合使用时,可以使用常见的标记尼罗河红、BODIPY 和 APOE 快速有效地识别脂质沉积。然后可以分析和以图形方式分析和显示使用该分析管道获得的汇总统计数据,从而可以轻松比较治疗条件。该协议的原理图如图 1所示。
图 1:方案示意图:RPE 细胞在 96 孔板上生长,并用活性人血清或纯化的牛外段攻击,以在体外模拟不同类型的视网膜变性。将RPE细胞固定并染色,以观察尼罗河红,BODIPY和APOE的脂蛋白沉积物。共聚焦显微镜用于获取荧光标记的脂质颗粒的Z堆栈,随后将其处理成2D最大强度投影。训练机器学习算法来识别和正确分割脂蛋白颗粒。生成包含颗粒计数和各种形状指标的汇总表,可用于后续绘图和统计分析。请点击此处查看此图的大图。
该协议提供了一种有效标记,成像和量化退行性眼病单基因和多基因 体外 疾病模型中脂质沉积的方法。基于人工智能的软件LipidUNet可应用于三种常见的脂质标志物,即APOE、Nile Red和BODIPY,并提供一种快速、自动的分析方法,使定量成为标准和无偏。
LipidUNet的主要局限性在于AI的训练数据集仅限于在96孔板中培养的细胞的40倍放大图像。作为训练图像集的结果,当前形式的LipidUNet仅限于分析40倍放大图像。该软件可用于分析除96孔板外在其他培养表面上培养的细胞的40倍图像,但应注意检查生成的输出掩模,以验证软件的准确阈值。需要更多的图像集(在不同的放大倍率下)来扩大它可以分析的样品/图像的范围。
该协议有几个关键步骤。在脂质标记步骤中,用户应确认他们选择的标记化合物(BODIPY,APOE,Nile Red)已有效标记其样品。成熟的RPE细胞通常色素沉着,这会损害抗体免疫染色的荧光信号。当荧光信号较弱或背景染色过多时,LipidUNet无法准确识别脂滴。出于类似的原因,必须使用正确选择协议自动成像步骤的采集设置。如果采集的图像质量较差,LipidUNet将难以正确屏蔽图像,因此定量将不准确(图6A-L)。最后,图像的后处理是一个重要的步骤,因为LipidUNet对软件的工作有特定的要求。
与使用手动阈值的脂质分析工作流程或斐济等软件中涉及自动阈值分析的技术相比,LipidUNet 在具有可变脂质沉积的图像中提供了无偏且可靠的分割,这反映在脂质颗粒鉴定中的小错误率(图 7)。该软件允许用户输入额外的训练图像,允许分析超出使用40倍放大镜的图像集,甚至是使用不同脂质标志物的图像集,如协议中所述。将来,该软件将被训练以分析3D图像,以便可以量化脂质沉积体积。将脂质沉积视为病理学主要因素的退行性眼病很普遍,随着老年人口的增加,预计病例还会增加13。正如我们在本协议中概述的那样,准确的疾病模型和有效的分析工具将允许开发新的治疗干预措施。
The authors have nothing to disclose.
我们感谢美国国家眼科研究所(NEI)组织学核心使用蔡司共聚焦系统。这项工作得到了NEI IRP基金的支持(授权号ZIA EY000533-04)。
0.22 µm Steriflip filter system | EMD Millipore | SCGP00525 | |
1x Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Gibco | 14190-144 | |
3,3',5-Triiodo-L-thyronine | Sigma | T5516 | |
Albumin Bovine, Fraction V | MP Biomedical | 160069 | |
Alexa Fluor 555 rabbit anti-goat IgG (H+L) | Invitrogen | A21431 | APOE secondary antibody |
APOE primary antibody | Millipore Sigma | AB947 | |
BODIPY 493/503 | Invitrogen | D3922 | Protect from light |
Complement competent human serum | Millipore Sigma | S1-LITER | |
CTS N2 Supplement | Life Technologies | A13707-01 | |
Fetal Bovine Serum | Hyclone | SH30071.03 | |
Fluoromount-G | SouthernBiotech | 0100-01 | Slide mounting media |
Glass Cover Slips #1 1/2 22 mm x 22 mm | Electron Microscopy Sciences | 72204-01 | |
Glass Microscope Slide 25 mm x 75 mm- 1.2 mm Thick | Electron Microscopy Sciences | 71870-01 | |
Hydrocortisone | Sigma | H0396 | |
MEM Alpha | Life Technologies | 12571-063 | |
MEM non-essential Amino Acids | Life Technologies | 11140 | |
Nile Red | Sigma | 72485-100MG | Protect from light |
Paraformaldehyde 16% Solution, EM Grade | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
Penicillin-Strep | Life Technologies | 15140-148 | |
Phosphate Buffered Saline 10x | Gibco | 70011-044 | |
Rod Outer Segments (OS) | InVision Bioresources | 98740 | |
Sodium bicarbonate | Sigma Aldrich | S5761 | |
Sodium Pyruvate | Life Technologies | 11360-070 | |
Sucrose | Sigma Aldrich | S1888 | |
SYBR Green Master Mix | Bio-Rad | 1725274 | |
Taurine | Sigma | T0625 | |
Triton X-100 | Sigma | 9002-93-1 | |
Tween 20 Ultrapure | Affymetrix | 9005-64-5 | |
Vitronectin | Life Technologies | A14701SA | |
Y-27632 dihydrochloride | R&D Systems | 1254 |